[發明專利]一種葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201810042320.1
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN108034003A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 王云鵬;邢少辰;韋正乙;范杰英
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C07K14/485
• 分類號: C07K14/485;C12N15/82;C07K1/34;C07K1/22
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

1.一種葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.編碼權利要求1所述的葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一種用于生產表皮生長因子hEGF蛋白的煙草葉綠體表達載體pWYP23404，其特征在于，該載體以16S-trnI和trnA-23S為左右同源序列，其間插入化學合成的Prrn-T7g10-GFP&EGF-aadA-Trps16表達盒；其中，Prrn啟動子和Trps16終止子分別為煙草葉綠體基因組的16S rRNA啟動子和rhct1基因mRNA 3'端成熟序列(GenBank登錄號：NC_001879)；所含的三個基因融合標簽基因GFP、目的基因EGF和篩選基因aadA均利用DNA2.0軟件進行了密碼子優化。

4.一種權利要求1所述的葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)構建煙草葉綠體表達載體pWYP23404；

2)EGF基因的煙草葉綠體轉化與同質化篩選，得到煙草葉綠體轉hEGF基因的同質化植株；

3)葉綠體轉基因煙草植株中hEGF表達量分析；

4)表皮生長因子hEGF蛋白的純化，得到葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白。

5.根據權利要求4所述的葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中的構建煙草葉綠體表達載體pWYP23404具體步驟如下：

1.1)、優化表皮生長因子hEGF，得到優化后的表皮生長因子hEGF，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

1.2)、構建煙草葉綠體表達載體pWYP23404：利用化學合成法全基因合成表達框，表達框包含以下兩部分：作為融合蛋白標簽的綠色熒光蛋白基因的C端添加柔性連接肽鏈與腸激酶識別位點構成的linker，即氨基酸序列為GSSSGSSSGSSSGSSSDDDDK；而作為篩選標記基因的壯觀霉素抗性基因置于帶有綠色熒光蛋白基因融合標簽的目的基因之后，共同構成由煙草葉綠體啟動子Prrn啟動、煙草葉綠體終止子Trps16終止的多順反子表達框，其中，煙草葉綠體啟動子Prrn含有核糖體結合位點T7g10序列；

1.3)人工合成的表達框在完成目的基因的插入后，利用Nsi I進行酶切消化處理后產生的片段與相同酶處理的攜帶克隆煙草葉綠體基因組中“16Srrn-trnI-trnA-23Srrn的大片段”的克隆載體pEASY-Nt進行連接反應，使人工合成的表達框插入trnI基因和trnA基因之間，最終獲得用于生產表皮生長因子的煙草葉綠體表達載體，命名為pWYP23404。

6.根據權利要求4所述的葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中的表皮生長因子hEGF蛋白的純化篩選具體為：將總可溶性蛋白經0.22μm濾膜抽濾后，置于截流分子量為50KD的超濾離心管中，4000g離心30min，取流出液，再置于截流分子量為30KD的超濾離心管中4000g離心45min后，截留部分液體即為N端融合GFP標簽的EGF生長因子的初步純化產物，利用腸激酶消化，使生長因子與GFP標簽蛋白分離開，再用肝素-Sepharose親和層析柱進行純化，得到葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白。