[發明專利]一種水稻葉綠體遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201810042314.6
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN110042119A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 邢少辰;王云鵬;韋正乙
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

本發明公開了一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，包括以下步驟：步驟(1)、水稻葉綠體表達載體的構建；步驟(2)、水稻葉綠體轉化和同質化篩選；步驟(3)、分子檢測。本發明首次獲得了同質化的水稻葉綠體轉基因愈傷組織和植株材料，并得到了相關分子證據。通過篩選獲得了適合于進行葉綠體轉化的水稻材料，該改良具有以下特征：具有高頻的再生能力；誘導產生的II性愈傷組織，在長期(大于6個月)繼代培養后仍具有良好的分化能力。通過比較證明了潮霉素比常用的壯觀霉素及其它篩選劑(抗生素或除草劑)更適合于作為水稻葉綠體轉化的篩選劑。

技術領域

本發明涉及一種水稻葉綠體遺傳轉化方法。

背景技術

植物葉綠體是一種半自主性的細胞器，擁有自己的基因組，因而是可以轉化的。葉綠體轉化通常是基因槍法或者PEG法通過直接轉化實現的，雖然有過通過農桿菌介導法轉化的報道，但是沒有得到重復。葉綠體轉化是外源基因DNA直接輸送到葉綠體，然后通過同源重組的方法把外源基因定點整合到葉綠體基因組上，是隨著基因槍法的發明而逐步確立的。

葉綠體轉化的研究比細胞核轉化起步晚，Boynton等用野生型衣藻葉綠體DNA轉化了atpB基因突變體細胞，使該突變體完全恢復光合作用能力，是葉綠體轉化開始的標志。1990年Svab等實現了高等模式煙草葉綠體的穩定轉化，從而開啟了高等植物葉綠體轉化的新紀元。到目前為止，除煙草以外，已在擬南芥、馬鈴薯、番茄、油菜、棉花、甘藍、胡蘿卜、萵苣、矮牽牛、大豆、楊樹、甜菜、茄子和紫花苜蓿等植物上獲得了穩定的葉綠體轉基因植株。

然而，上述實現葉綠體轉化的植物都屬于雙子葉植物，單子葉植物的葉綠體轉化一直沒有獲得成功，而許多重要的作物，如水稻、玉米、小麥和高粱等，都是單子葉植物。目前僅僅在水稻上獲得了非同質化的葉綠體轉基因植株，要獲得同質化的葉綠體轉基因植株，還有很多的難關需要攻克。

發明內容

針對上述現有技術存在的問題，本發明提供一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，為實現水稻成功葉綠體轉化和葉綠體基因工程改良在水稻育種中的應用打下技術基礎。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，包括以下步驟：

步驟(1)、水稻葉綠體表達載體的構建；

步驟(2)、水稻葉綠體轉化和同質化篩選；

步驟(3)、分子檢測。

優選的是，步驟(1)之前還包括：適合葉綠體轉化的水稻基因型篩選與高頻再生體系建立。

上述任一方案優選的是，所述適合葉綠體轉化的水稻基因型篩選與高頻再生體系建立的方法包括：水稻幼穗愈傷組織的誘導、愈傷組織的分化愈傷組織的多輪繼代培養、再生植株生根與移栽。

上述任一方案優選的是，步驟(1)中載體構建方法包括：水稻總DNA的提取、水稻葉綠體同源重組片段的獲得、HPT基因密碼子優化及表達框設計、線性化載體的準備、插入片段的準備、重組載體的無縫連接.

上述任一方案優選的是，所述水稻葉綠體同源重組片段的獲得方法為：將提取的水稻總DNA作為PCR擴增的模板，根據Genbank上的水稻葉綠體序列設計引物OsF、OsR擴增水稻葉綠體基因組中的 16S-trnI-trnA-23S片段，作為葉綠體轉化載體中的側翼同源序列，PCR反應后篩選出重組克隆，重組質粒為pEASY Bs-Os。

上述任一方案優選的是，所述插入片段的準備：質粒DNA小量提取法提取質粒pEASY-Ossynth，將其濃度稀釋后為模板，利用 TransStart FastPfu HS DNA polymerase進行PCR擴展目的片段，所獲得的PCR產物回收，即為插入片段。