[發明專利]一種水稻葉綠體遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201810042314.6
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN110042119A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 邢少辰;王云鵬;韋正乙
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

1.一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)、水稻葉綠體表達載體的構建；

步驟(2)、水稻葉綠體轉化和同質化篩選；

步驟(3)、分子檢測。

2.根據權利要求1所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，步驟(1)之前還包括：適合葉綠體轉化的水稻基因型篩選與高頻再生體系建立。

3.根據權利要求2所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，所述適合葉綠體轉化的水稻基因型篩選與高頻再生體系建立的方法包括：水稻幼穗愈傷組織的誘導、愈傷組織的分化愈傷組織的多輪繼代培養、再生植株生根與移栽。

4.根據權利要求1所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，步驟(1)中載體構建方法包括：水稻總DNA的提取、水稻葉綠體同源重組片段的獲得、HPT基因密碼子優化及表達框設計、線性化載體的準備、插入片段的準備、重組載體的無縫連接。

5.根據權利要求4所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，所述水稻葉綠體同源重組片段的獲得方法為：將提取的水稻總DNA作為PCR擴增的模板，根據Genbank上的水稻葉綠體序列設計引物OsF、OsR擴增水稻葉綠體基因組中的16S-trnI-trnA-23S片段，作為葉綠體轉化載體中的側翼同源序列，PCR反應后篩選出重組克隆，重組質粒為pEASY Bs-Os。

6.根據權利要求4所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，所述插入片段的準備：質粒DNA小量提取法提取質粒pEASY-Ossynth，將其濃度稀釋后為模板，利用TransStart FastPfu HS DNA polymerase進行PCR擴展目的片段，所獲得的PCR產物回收，即為插入片段。

7.根據權利要求4所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，所述重組載體的無縫連接方法：將獲得的載體片段和插入片段建立連接體系，將重組的混合液體轉化大腸桿菌感受態細胞Mach1，涂于含卡那霉素和氨芐青霉素的平板上，過夜培養，挑取單菌落至含抗生素的LB培養液中，振蕩過夜培養；將獲得的菌液提取重組質粒，稀釋后作為模板，進行PCR鑒定，即獲得水稻葉綠體表達載體pWYP23151。

8.根據權利要求1所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，步驟(2)中水稻葉綠體轉化方法包括：水稻外植體準備、提取水稻表達載體pWYP23151將其包埋于金粉顆粒上、基因槍轟擊。

9.根據權利要求1所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，步驟(2)之后還包括同質化水稻葉綠體轉化愈傷組織的分化。

10.根據權利要求1所述的一種水稻葉綠體遺傳轉化方法，其特征在于，步驟(3)中分子檢測包括：目的基因和選擇性標記基因的PCR檢測；同質化進程的PCR檢測；Southern blot分析；GFP熒光檢測；外源蛋白表達分析。