[發明專利]ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810040405.6
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108103155A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 王昕昀
• 申請（專利權）人: 良培基因生物科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明公開了一種ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的引物及其檢測方法。以數字PCR為檢測平臺，針對3種型別的BCR/ABL融合基因，設計合成用于檢測BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因檢測探針、內參基因的上下游引物和內參基因檢測探針，并將待測樣品cDNA模板、用于檢測BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因檢測探針、內參基因的上下游引物、內參基因檢測探針以及PCR預混液混合，制備ddPCR微反應液滴進行PCR擴增反應，根據熒光信號類型判斷待測樣品中是否含有融合基因模板及其數量和含量。本發明的引物和探針的設計特異性強，結合數字PCR技術檢測靈敏度更高，通過軟件自動化進行結果判讀，避免產生假陰性結果，因此可以用于少量白血病細胞進行檢測，減少患者復發的可能。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中基因的分子生物學檢測，尤其涉及一種ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的引物及其檢測方法。

背景技術

abl為一原癌基因，位于9號染色體q34，基因產物是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶；bcr基因位于22號染色體q11，正常的bcr基因產物為160kD的胞質磷酸蛋白，由于t(9；22)(q34；q11)的易位，形成bcr/abl融合基因，該易位產生bcr/abl嵌合基因，基因產物為210kD的融合蛋白，它的表達激活了酪氨酸蛋白激酶，改變了細胞的蛋白酪氨酸水平和肌動蛋白結合能力，擾亂了正常的信號傳導途徑，抑制了凋亡的發生。

bcr基因斷裂點集中在三個區域:主要(majorbcr，M-bcr)、次要(minorbcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)。abl基因斷裂位于第1或第2內含子。因斷裂點不一，bcr-abl融合基因及其mRNA和蛋白產物呈多樣性。根據bcr基因斷裂點的不同，主要有下述幾種類型的bcr/abl融合形式:①在典型的CML中，大部分融合基因是在主要斷裂點簇集區(M-bcr)內斷裂融合而成，由此形成的bcr/abl融合mRNA是由b3a2或b2a2轉錄而成，其最終產物是相對分子質量210×103的胞漿蛋白P210，這種癌蛋白是絕大多數慢性期CML表型異常的根源所在；②當bcr基因斷裂點發生在上游的一段長約54.4kb的內含子，也稱m-bcr區，產生一個e1a2接頭的雜合mRNA，編碼P190融合蛋白；③bcr斷裂點也可在M-bcr區的下游，即μ-bcr，產生e19a2融合，編碼P230融合蛋白。

bcr/abl融合基因存在于95％以上的慢性粒細胞白血病患者，是CML最重要的分標志，是疾病狀態的決定性因素。在一部分成人急性淋巴細胞性白血病(20％－30％)、兒童急性淋巴細胞白血病(2％－10％)和急性粒細胞性白血病的患者中也可表達bcr/abl融合基因。

目前常用的檢測BCR/ABL融合基因導致慢性髓細胞白血病(CML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)有以下5種方法，

(1)形態學檢查，由于白血病細胞的高度異質性和多態性，重復性差，易受主觀因素的影響，其診斷一致率約60％-80％。

(2)免疫學檢測方法，主要有兩種：細胞涂片法和流式細胞術(FCM)，細胞涂片法所需設備簡單，可在顯微鏡下清楚地判斷細胞抗原和抗體結合的部位，尤其對細胞內抗原進行檢測時較易排除因細胞膜滲透處理帶來的非特異性反應，但目測不易對大量細胞進行計數，故敏感度較低，一般為10-2，目前主要用于細胞內抗原的檢測；而FCM可同時對一個細胞中2個以上的抗原進行檢測，并對大量細胞進行快速分析，準確客觀、簡單方便，但是FCM法需特殊儀器，操作技術要求高，價格昂貴，結果的重復性欠佳。

(3)細胞遺傳學檢測方法，常規應用直接法或短期培養法進行染色體RHG顯帶，但是白血病細胞分裂指數低，染色體形態短小，常顯帶不清，使得一些結構復雜或細微的改變難以準確識別。