[發明專利]ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810040405.6
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108103155A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 王昕昀
• 申請（專利權）人: 良培基因生物科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的引物和探針，其特征在于，用于檢測BCR/ABLP210融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于檢測BCR/ABL P190融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，用于檢測BCR/ABL P230融合基因的上游引物序列如SEQID NO：3所示；用于檢測BCR/ABLP210融合基因和BCR/ABL P190融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：4所示，用于檢測BCR/ABLP230融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示；BCR/ABL融合基因檢測探針序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根據權利要求1所述的ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的引物和探針，其特征在于，所述檢測BCR/ABL融合基因探針為經過熒光標記的，其5’端標記有報告基團，3’端標記有非熒光淬滅基團。

3.一種基于ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包含以下步驟：

1)提取受試者骨髓、外周血或組織的RNA提取；

2)將步驟1)提取的RNA反轉錄成cDNA；

3)以cDNA為模板，將待測樣品cDNA模板、用于檢測BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因檢測探針、內參基因的上下游引物、內參基因檢測探針以及PCR預混液混合，制備ddPCR混合液；

所述BCR/ABL融合基因包括BCR/ABL P210融合基因、BCR/ABLP190融合基因和BCR/ABLP230融合基因，用于檢測BCR/ABL P210融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于檢測BCR/ABL P190融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，用于檢測BCR/ABL P230融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示；用于檢測BCR/ABL P210融合基因和BCR/ABLP190融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：4所示，用于檢測BCR/ABL P230融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示；BCR/ABL融合基因檢測探針序列如SEQ ID NO：6所示；內參基因的上下游引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，內參基因檢測探針序列如SEQID NO：9所示；

4)ddPCR混合液制作PCR微反應液滴，再進行PCR擴增反應；

5)收集信號并進行結果判讀：PCR擴增反應后的產物進行信號收集，根據熒光信號類型判斷待測樣品中是否含有融合基因模板及其數量和含量。

4.根據權利要求3所述的一種基于ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cDNA模板的含量為3～8ng/μL。

5.根據權利要求3所述的一種基于ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均為400～700nM，BCR/ABL融合基因檢測探針含量為200～400nM。

6.根據權利要求3所述的一種基于ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，ddPCR混合液中內參基因上游和下游引物含量均為400～700nM，內參基因檢測探針含量為200～400nM。

7.根據權利要求3所述的一種基于ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，步驟4)中ddPCR混合液制作PCR微反應液滴的方法為：將ddPCR混合液加入微滴發生器，生成10000-20000個微反應液滴。

8.根據權利要求3所述的一種基于ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，步驟4)中PCR擴增反應條件為：93-97℃預變性3-15分鐘；93-95℃變性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共進行35-45個循環，2-10℃終止反應。

9.根據權利要求8所述的一種基于ddPCR技術檢測BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，步驟4)中PCR擴增反應條件為：95℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火/延伸1分鐘，共進行40個循環，10℃終止反應。