[發(fā)明專利]高效價(jià)抗CSFV單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810040297.2
• 申請(qǐng)日: 2018-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN107936116A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王瑞寧;李存法;馬霞;趙孟孟;陳忠杰;盧婷婷;劉永錄;宋幸輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K16/10
• 分類號(hào): C07K16/10;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 河南科技通律師事務(wù)所41123
• 代理人: 張曉輝,樊羿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效價(jià)抗CSFV單克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)

豬瘟（classical swine fever，CSF）在中國被列為一類傳染病，病原是豬瘟病毒。豬瘟病毒是有囊膜的單股正鏈 RNA病毒，屬于黃病毒科、瘟病毒屬，其分子量約為 4×10⁶，病毒粒子大小大約在40～70nm，略呈圓形或橢圓形，具有脂蛋白囊膜，從電鏡照片中可觀察到囊膜圍繞著等軸的核心，內(nèi)部核心直徑大約30nm，核衣殼呈二十面體對(duì)稱，6～8nm類似穗樣的纖突結(jié)構(gòu)存在于病毒粒子的表面，同種屬成員的還包括羊邊界病病毒和牛黏膜病病毒。

CSFV是單股正鏈RNA病毒，具有感染性，而且本身就可作為mRNA，僅含有一個(gè)大的開放閱讀框，其兩端為高度保守的非編碼區(qū)，而且5′端無甲基化帽子結(jié)構(gòu)，3′端無多聚腺苷酸尾巴，ORF編碼一個(gè)多聚蛋白前體包含有3898個(gè)氨基酸殘基的，在宿主細(xì)胞和病毒自身的酶共同裂解作用下可裂解為12種蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因靠近基因組5′端，分別為C、E0、E1、E2。

E2囊膜糖蛋白編碼373個(gè)氨基酸殘基，位于CSFV多聚蛋白的第690～1062位氨基酸殘基，編碼E2蛋白的結(jié)構(gòu)基因是與病毒毒力有關(guān)的基因，它是一種中和性抗原蛋白，除了能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，還能夠激發(fā)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，它是CSFV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白。E2蛋白由 3～8個(gè)氨基酸殘基組成的抗原表位根據(jù)結(jié)構(gòu)的差別，分為兩種抗原表位，分別為連續(xù)性及不連續(xù)性。連續(xù)性抗原表位見于 T細(xì)胞表位和部分 B細(xì)胞表位，又稱為線性表位，不連續(xù)抗原表位只見于 B細(xì)胞抗原表位，又稱為構(gòu)象型表位。CSFV與BVDV和BDV的區(qū)別主要表現(xiàn)在E2蛋白上。

E0蛋白的分子量約為44～48 kDa。E0以分子質(zhì)量約 100 kDa的同源二聚體的形式出現(xiàn)在CSFV感染的細(xì)胞或病毒粒子中，感染CSFV的細(xì)胞會(huì)分泌大量的E0到細(xì)胞培養(yǎng)液中。E0蛋白的C末端氨基酸和N末端氨基酸分別為Ala-494和Glu-268。E0蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，其C末端存在一個(gè)膜錨定結(jié)構(gòu)，但與囊膜結(jié)合力較弱，很容易從囊膜上游離下來，該膜錨定結(jié)構(gòu)對(duì)子代病毒的感染性至關(guān)重要。E0蛋白位于CSFV的表面，E0的一些抗原表位是暴露在外的，它既是一種結(jié)構(gòu)蛋白，而且還是一種功能性蛋白，存在大量重要的抗原表位。E0蛋白具有RNase活性，能夠降解病毒和細(xì)胞的RNA，它是一種尿嘧啶特異的核酸酶，可以表現(xiàn)出多種生物活性。RNase除了能夠降解RNA外，還具有神經(jīng)毒性，抗蠕蟲、抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等作用。E0蛋白在病毒入侵易感細(xì)胞時(shí)發(fā)揮著重要作用，例如CSFV通過E0和E2兩個(gè)囊膜糖蛋白分別作用于細(xì)胞表面的不同受體來完成對(duì)SK-6細(xì)胞的感染。E0吸附細(xì)胞的能力被抑制后，病毒粒子就得依靠E1和E2介導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。E0同E2囊膜糖蛋白一樣均可誘發(fā)豬產(chǎn)生抗CSFV的中和性抗體。

目前， RT-PCR、巢式RT-PCR、限制性片段長(zhǎng)度-巢式RT-PCR（RFLP）、實(shí)時(shí)定量 PCR、RT-LAMP等檢測(cè)方法均已用于檢測(cè)豬瘟病毒。然而，此類方法成本高，不適合大批量樣品的檢測(cè)；比較煩瑣而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無法在基層推廣應(yīng)用。

因此，急需一種用于大批量樣本檢測(cè)的高效價(jià)抗CSFV單克隆抗體的制備方法，以便于低成本、既簡(jiǎn)單又快速且靈敏的測(cè)定豬瘟病毒抗原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效價(jià)抗CSFV單克隆抗體的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

經(jīng)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，目前獸用單克隆抗體的制備中，免疫原含有較多的動(dòng)物組織、細(xì)胞成分和培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)都易使接種者產(chǎn)生過敏等不良的反應(yīng)，因此需要通過純化技術(shù)去除如培養(yǎng)基中的雜蛋白、糖脂類及核酸等大部分生物源性雜質(zhì)，完成免疫活性成分的濃縮富集和純化工作，這樣可大大地降低甚至避免接種后發(fā)生的副反應(yīng)發(fā)生率，更加安全有效。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

設(shè)計(jì)一種高效價(jià)抗CSFV單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）制備免疫原：培養(yǎng)豬瘟病毒后，采用先切向流超濾，后過瓊脂糖凝膠過濾層析柱的方法將豬瘟病毒濃縮和純化；

（2）以所述濃縮和純化后的免疫原免疫小鼠；

（3）融合所述小鼠免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞，獲得雜交瘤細(xì)胞；

（4）采用先豬瘟抗體檢測(cè)試紙檢測(cè)，再IPMA檢測(cè)結(jié)合間接ELISA的方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆；