[發明專利]高效價抗CSFV單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201810040297.2
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN107936116A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 王瑞寧;李存法;馬霞;趙孟孟;陳忠杰;盧婷婷;劉永錄;宋幸輝
• 申請（專利權）人: 河南牧業經濟學院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 河南科技通律師事務所41123
• 代理人: 張曉輝,樊羿

1.一種高效價抗CSFV單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）制備免疫原：培養豬瘟病毒后，采用先切向流超濾濃縮，后過瓊脂糖凝膠過濾層析柱的方法將豬瘟病毒純化；

（2）以所述濃縮和純化后的免疫原免疫小鼠；

（3）融合所述小鼠免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞，獲得雜交瘤細胞；

（4）采用先豬瘟抗體檢測試紙檢測，再IPMA檢測結合間接ELISA的方法篩選陽性雜交瘤細胞并進行克??；

（5）對陽性克隆進行克隆化培養，得豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株；

（6）將所述雜交瘤細胞株注射于小鼠腹腔生產單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的高效價抗CSFV單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在步驟（1）中，所述切向流超濾時，真空泵進口壓力為0.1MPa，回流壓力為0.05MPa，樣品反復被50kDa超濾膜截留收集于收樣杯中，直至濃縮體積至20mL。

3.根據權利要求1所述的高效價抗CSFV單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在步驟（1）中，所述瓊脂糖凝膠過濾層析柱為Sepharose 4 Fast Flow，流速為0.3 mL/min。

4.根據權利要求1所述的高效價抗CSFV單克隆抗體的制備方法，其特征在于，在步驟（4）中，所述間接ELISA的方法包括以下步驟：

a. 包被：使用0.05M CBS將 E0-E2融合蛋白包被于96孔板，每孔100μL，4℃包被過夜；

b. 封閉：用5%脫脂奶封閉，37℃作用1h，PBST洗滌三次；

c. 樣品：使用PBS稀釋雜交瘤上清等進行檢測，每孔100μL，37℃，30min后，PBST洗滌三次；

d. 酶標二抗的反應：每孔加入100μL 1：1000倍稀釋的羊抗豬或抗鼠的酶標二抗，37℃，30min后，PBST洗滌三次；

e. 顯色與終止：將TMB顯色試劑每孔加入100μL，顯色5min后加入2M H₂SO₄終止反應，測定OD₄₅₀值。

5.一種權利要求1所述高效價抗CSFV單克隆抗體的制備方法制備的抗CSFV單克隆抗體在CSFV定性或定量檢測中的應用。

6.一種由權利要求1所述制備方法制備的抗CSFV單克隆抗體所制備的檢測CSFV的阻斷 ELISA試劑盒。

7.根據權利要求6所述檢測CSFV的阻斷 ELISA試劑盒，其特征在于，其中抗原包被的濃度為0.625～5μg/mL，待檢血清稀釋度為1：1～50。

8.根據權利要求6所述檢測CSFV的阻斷 ELISA試劑盒，其特征在于，其中封閉液為5%脫脂奶、1%BSA、1%OVA、2%明膠中的至少一種。

9.根據權利要求6所述檢測CSFV的阻斷 ELISA試劑盒，其特征在于，其中酶標單抗的濃度為1：2000～16000，酶標單抗的孵育時間為0.5～2h。

10.根據權利要求6所述檢測CSFV的阻斷 ELISA試劑盒，其特征在于，其中底物顯色的作用時間為5～20min。