[發明專利]一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201810040107.7
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108373991A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 裴軼勁;魏含清;李洪梅;蔣楊;王丹丹
• 申請（專利權）人: 廣東醫科大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/077
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 44215
• 代理人: 王雪镅

本發明涉及體外細胞分離和培養技術領域，具體涉及一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒及方法。該用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒，含有以下四種濃度的胰蛋白酶?乙二胺四乙酸消化液。該方法，包括：步驟一，剪碎；步驟二，A液消化；步驟三，B液消化；步驟四，C液消化；步驟五，D液消化；步驟六，培養。該消化液試劑盒由于含有四種濃度的胰蛋白酶?乙二胺四乙酸消化液，因此，該消化液試劑盒既能富集細胞數量又能避免對細胞的過度消化而使細胞損傷。該方法將不同濃度的胰蛋白酶?乙二胺四乙酸消化液按照濃度從高到低的順序依次消化原代小鼠胚胎，該方法既能富集細胞數量又能避免對細胞的過度消化而使細胞損傷。

技術領域

本發明涉及體外細胞分離和培養技術領域，具體涉及一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒及方法。

背景技術

現有技術中，從孕小鼠12-16天胚胎中分離原代胚胎成纖維細胞的過程大致如下，取出胚胎，去掉頭尾四肢內臟后，將剩下的部分盡量剪碎，加消化酶消化，中止后，離心獲取細胞沉淀，用含血清的培養液打成單細胞懸液，分瓶培養傳代。通常使用的消化酶為胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)，用一種濃度在37攝氏度下作用一定時間，然后獲得單細胞懸液。但這樣的方法存在的問題是：剪碎組織塊有大有小，細胞從組織塊中消化出來的時間不一，而消化液濃度和時間只有一種，有時可能因未消化不夠，獲得的單細胞量不夠，或可能消化過度，有的細胞受損，使細胞貼壁或傳代效率降低。

發明內容

本發明的目的之一在于針對現有技術的不足，提供一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒，該用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒既能富集細胞數量又能避免對細胞的過度消化而使細胞損傷。

本發明的目的之二在于針對現有技術的不足，提供一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，該方法既能富集細胞數量又能避免對細胞的過度消化而使細胞損傷。

為了實現上述目的之一，本發明采用如下技術方案：

提供一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒，含有以下四種濃度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分別為A液、B液、C液和D液，其中，A液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.15％，B液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.08％，C液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.04％，D液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.02％。

所述消化液試劑盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分裝。

為了實現上述目的之二，本發明采用如下技術方案：

提供一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，通過使用上述所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒進行分離原代小鼠胚胎成纖維細胞，具體包括以下步驟：

步驟一，剪碎：將去掉頭尾四肢和內臟的小鼠胚胎剪碎后放入A液中，并在室溫下繼續進行剪碎，得到剪碎組織；

步驟二，A液消化：步驟一的剪碎組織在A液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟三，B液消化：將步驟二中收集上清液后剩下的沉淀懸液加入B液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟四，C液消化：將步驟三中收集上清液后剩下的沉淀懸液加入C液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟五，D液消化：將步驟四中收集上清液后剩下的沉淀懸液加入D液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟六，培養：將步驟二至步驟五中收集的并加入了培養液的上清液混合后，進行離心得到細胞沉淀，然后用培養液對細胞沉淀進行懸浮，然后接種在培養瓶上培養。