[發明專利]一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201810040107.7
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108373991A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 裴軼勁;魏含清;李洪梅;蔣楊;王丹丹
• 申請（專利權）人: 廣東醫科大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/077
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 44215
• 代理人: 王雪镅

1.一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒，其特征在于：含有以下四種濃度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分別為A液、B液、C液和D液，其中，A液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.15％，B液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.08％，C液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.04％，D液含有胰蛋白酶的質量濃度為0.02％。

2.根據權利要求1所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒，其特征在于：所述消化液試劑盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分裝。

3.一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，其特征在于：通過使用權利要求1或2所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的消化液試劑盒進行分離原代小鼠胚胎成纖維細胞，具體包括以下步驟：

步驟一，剪碎：將去掉頭尾四肢和內臟的小鼠胚胎剪碎后放入A液中，并在室溫下繼續進行剪碎，得到剪碎組織；

步驟二，A液消化：步驟一的剪碎組織在A液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟三，B液消化：將步驟二中收集上清液后剩下的沉淀懸液加入B液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟四，C液消化：將步驟三中收集上清液后剩下的沉淀懸液加入C液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟五，D液消化：將步驟四中收集上清液后剩下的沉淀懸液加入D液中進行消化作用一定時間，然后收集上清液，并往上清液中加入培養液以中止胰蛋白酶的消化；

步驟六，培養：將步驟二至步驟五中收集的并加入了培養液的上清液混合后，進行離心得到細胞沉淀，然后用培養液對細胞沉淀進行懸浮，然后接種在培養瓶上培養。

4.根據權利要求3所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，其特征在于：所述步驟一中，利用眼科剪進行剪碎。

5.根據權利要求3所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，其特征在于：所述步驟二至步驟五中，所述消化作用的溫度均為36℃～38℃，所述消化作用的時間均為3min～7min。

6.根據權利要求5所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，其特征在于：所述步驟二至步驟五中，所述消化作用的溫度均為37℃，所述消化作用的時間均為5min。

7.根據權利要求3所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，其特征在于：所述步驟二至步驟五中，所述培養液均為含胎牛血清的DMEM。

8.根據權利要求7所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，其特征在于：所述培養液均為含體積分數為10％～20％的胎牛血清的DMEM。

9.根據權利要求3所述的一種用于分離原代小鼠胚胎成纖維細胞的方法，其特征在于：所述步驟六中，接種在培養瓶上培養的培養條件為：將培養瓶置于含體積分數5％的CO₂，溫度為37℃的飽和濕度培養箱中培養。