[發明專利]一種新型低分子量肝素的制備方法

在審

• 申請號: 201810039954.1
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108179161A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 陳蔭;趙玉勤;孫坤來;王斌
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

一種新型低分子量肝素的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟：a）Phe?Leu?Asn?Gln?Asp和sepharose交聯；b）交聯后凝膠加入8倍體積46mM磷酸鈉緩沖液，溶脹后吸去上清；c）肝素溶在1倍體積緩沖液中，0.5mg凝膠配比3mg肝素的比例上樣，攪拌靜置15min，吸去上清；d）肝素的活性中心位點吸附在凝膠的五肽上后，加入2 mU肝素酶II，在水浴中攪拌水解；e）離心，取沉淀；f）沉淀中加入一倍體積的1M的NaCl溶液后離心，取上清；g）加熱使酶滅活離心去除酶的沉淀，上清濃縮后bio?gel P2柱子去掉鹽分自動部分收集，去掉鹽分，收集有紫外吸收部分合并，凍干即得到脫鹽后不含活性位點的低分子量肝素。

技術領域

本發明涉及的是一種新型低分子量肝素的制備方法，屬于生化技術領域。

背景技術

肝素抗凝活性取決于它與絲氨酸蛋白酶抑制劑、抗凝血酶III(AT)的相互作用。在與肝素結合的過程中，AT發生了一種構象變化，增強了其不可逆轉的抑制凝血酶的能力，包括凝血酶和因子Xa。肝素-AT相互識別是研究較為透徹的多糖和蛋白相互作用的實例。肝素和AT的識別和依賴于肝素中特定的肝素五糖結構區域。而這特定的肝素五糖在結構上的主要特征是在五糖中間的氨基葡萄糖殘基存在3-O硫酸基修飾。低分子量肝素三位硫酸化修飾的片段減少，分子量降低，所以活性降低，但是安全性增加。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，而提供一種能提高生物活性和安全性的新型低分子量肝素的制備方法。

本發明的目的是通過如下技術方案來完成的，一種新型低分子量肝素的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟：

a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交聯；

b）交聯后凝膠加入8—12倍體積46—54mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2—7.5，溶脹后吸去上清；

c）肝素溶在1—1.5倍體積緩沖液中，0.5—1.5mg凝膠配比3mg肝素的比例上樣，上樣后玻璃棒攪拌3—10min后，靜置15—35min，吸去上清；

d）肝素的活性中心位點吸附在凝膠的五肽上后，按1—5mg肝素加入2 mU肝素酶II的比例，在水浴中35—40 ℃攪拌水解2—5h；

e）肝素游離的部分就被隨機部分水解，水解后4000rpm離心，取沉淀；

f）沉淀中加入一倍體積的1M的NaCl溶液后離心，取上清；

g）85—95 ℃水浴加熱10—20min使酶滅活，4000rpm離心去除酶的沉淀，上清濃縮后bio-gel P2柱子去掉鹽分自動部分收集，220nm紫外檢測，去掉鹽分，收集有紫外吸收部分合并，凍干即得到脫鹽后不含活性位點的低分子量肝素。

作為優選：所述的步驟b）中，交聯后凝膠加入10倍體積50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4，溶脹后吸去上清；

所述的在步驟c）中，肝素溶在1倍體積緩沖液中，1mg凝膠配比3mg肝素的比例上樣，上樣后玻璃棒攪拌5min后，靜置20min，吸去上清；

所述的步驟d）中，肝素的活性中心位點吸附在凝膠的五肽上后，按3mg肝素加入2 mU肝素酶II的比例，在水浴中37 ℃攪拌水解4h。

所述的步驟g）中，90 ℃水浴加熱15min使酶滅活。

本發明不含有凝血酶結合位點，完全酶解后，三位硫酸化四糖的含量低于0.5%。該低分子量肝素可以作為對照品用于三位硫酸化的含量對肝素生物活性影響的研究的陰性對照品；具有提高生物活性和安全性等特點。

具體實施方式