[發明專利]原代小膠質細胞/損傷神經元共培養體系及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201810038929.1
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108251372A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 郭楊;潘婭嵐;馬勇;周龍云;苑文超;鄭蘇陽;黃桂成;王磊
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/0793
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

本發明公開了原代小膠質細胞/損傷神經元共培養體系及其構建方法和應用，所述體系包括原代小膠質細胞和損傷神經元，其中，損傷神經元被原代小膠質細胞吞噬于胞內；所述體系為體外共培養體系。本發明所述原代小膠質細胞/損傷神經元共培養體系較傳統方法培養的靜息小膠質細胞的不足，模擬神經損傷的微環境以激活小膠質細胞，保留了小膠質細胞的吞噬功能；本發明所述體系中的小膠質細胞能夠被損傷神經元激活為巨噬細胞，增強其吞噬神經元碎片的能力；本發明所述方法構建的體系中原代細胞數量可觀、性狀穩定、活性較高，能夠為后續的神經損傷或退變性疾病的基礎研究提供可靠的共培養體系。

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種共培養體系，具體為原代小膠質細胞/損傷神經元共培養體系及其構建方法和應用。

背景技術

脊髓損傷是嚴重影響身心健康的高致殘性疾病，其治療和康復的費用高、難度極大，給個人、家庭及社會均帶來了沉重的負擔，故一直為醫學界研究的難點與熱點。小膠質細胞是中樞神經系統(CNS)中巨噬細胞源性免疫調節細胞，脊髓損傷等神經病理性改變發生后，小膠質細胞迅速激活，調控免疫應答，清理細胞碎片，對損傷后CNS的微環境的調節具有重要意義。如何研究小膠質細胞在CNS微環境中的作用是進一步研究藥物綜合調控的關鍵。

由于小膠質細胞占CNS細胞總量較少，故對于提取、純化原代小膠質細胞存在一定難度。隨著技術的發展及改革，提純小膠質細胞的方法已經從傳統的振蕩、溫和酶消化法等轉向流式、磁珠分選等，只要條件許可，便能較為容易的分離到純度較高的小膠質細胞。然而即使提純到純度較高的原代小膠質細胞，實驗中亦常常面臨著另一個重大問題，即該細胞純化后增殖能力顯著減弱，培養時細胞不斷老化，數量不斷減少，最終導致體外培養的失敗。故而如何提純、成功培養原代小膠質細胞，利于原代細胞進行實驗，以獲得更可靠的實驗結果，依舊是科研中存在的難點之一。

目前研究CNS中小膠質細胞的吞噬作用的方法國內外文獻報道主要為體內研究，或單一小膠質細胞或細胞系對墨水或熒光微球等吞噬的體外研究，而未見體外原代小膠質細胞對損傷神經元的吞噬作用。這不僅不利于模擬脊髓損傷后的微環境，而且常導致提取的原代小膠質細胞不能很好地發揮吞噬作用，促進神經再生效果較差。

因此，構建一種小膠質細胞/損傷神經元共培養體系，高效地激活小膠質細胞的吞噬作用，為進一步探索藥物促進小膠質細胞吞噬作用及多靶點改善微環境顯得尤為重要。

發明內容

解決的技術問題：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種能夠高效激活小膠質細胞的吞噬作用，保證分離獲得的細胞具有良好的細胞活性和分化能力，本發明提供了原代小膠質細胞/損傷神經元共培養體系及其構建方法和應用。

技術方案：原代小膠質細胞/損傷神經元共培養體系，所述體系包括原代小膠質細胞和損傷神經元，其中，損傷神經元被原代小膠質細胞吞噬于胞內；所述體系為體外共培養體系。

所述的原代小膠質細胞/損傷神經元共培養體系的構建方法，包括以下步驟：

第1步、小膠質細胞分離

a、無菌條件下分離新生一周內的SD大鼠腦皮質剪碎，胰酶消化15min；

b、終止消化，加入完全培養基緩慢吹打，靜置后吸取上清；2000r/min×2min離心1次，棄上清，完全培養基重懸接種；4h及24h后更換培養基，之后每2-3天更換一次培養基；

c、取步驟b培養15d后的細胞，吸取原培養基并保留，潤洗后加入DMEM/F12稀釋的胰酶孵育25-40分鐘，終止消化，胰酶濃度為0.05％～0.0625％；

d、小心吸去未貼壁細胞或細胞碎片，加入混合培養基繼續培養；

第2步、原代神經元分離、培養、構建神經元損傷模型

e、無菌條件下分離18d胎鼠海馬體剪碎，培養箱中胰酶消化15min，血清終止消化；