[發(fā)明專利]原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系及其構建方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810038929.1
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108251372A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設計）人: 郭楊;潘婭嵐;馬勇;周龍云;苑文超;鄭蘇陽;黃桂成;王磊
• 申請（專利權）人: 南京中醫(yī)藥大學
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/0793
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

1.原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系，其特征在于，所述體系包括原代小膠質細胞和損傷神經元，其中，損傷神經元被原代小膠質細胞吞噬于胞內；所述體系為體外共培養(yǎng)體系。

2.權利要求1所述的原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

第1步、小膠質細胞分離

a、無菌條件下分離新生一周內的SD大鼠腦皮質剪碎，胰酶消化15min；

b、終止消化，加入完全培養(yǎng)基緩慢吹打，靜置后吸取上清；2000r/min×2min離心1次，棄上清，完全培養(yǎng)基重懸接種；4h及24h后更換培養(yǎng)基，之后每2-3天更換一次培養(yǎng)基；

c、取步驟b培養(yǎng)15d后的細胞，吸取原培養(yǎng)基并保留，潤洗后加入DMEM/F12稀釋的胰酶孵育25-40分鐘，終止消化，胰酶濃度為0.05％～0.0625％；

d、小心吸去未貼壁細胞或細胞碎片，加入混合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

第2步、原代神經元分離、培養(yǎng)、構建神經元損傷模型

e、無菌條件下分離18d胎鼠海馬體剪碎，培養(yǎng)箱中胰酶消化15min，血清終止消化；

f、加入完全培養(yǎng)基均勻吹打、移取上清，離心后接種于含2％B27的完全培養(yǎng)基；

g、4h后更換培養(yǎng)基，加入阿糖胞苷培養(yǎng)，阿糖胞苷的干預濃度為8～12μM，24h后更換培養(yǎng)基；

h、取步驟g培養(yǎng)7-12d的神經元，潤洗后加入含谷氨酸的DMEM/F12干預30min，

谷氨酸的干預濃度為100μM，換新鮮含B27的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h；

i、取步驟h的細胞經AnnexinV-FITC/PI雙染流式檢測鑒定神經元凋亡；

第3步、小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系

j、取步驟d培養(yǎng)1-2d后的小膠質細胞鑒定，取步驟g培養(yǎng)7-12d神經元鑒定，按步驟h制備神經元損傷模型

k、取步驟d中培養(yǎng)1-2d后的小膠質細胞，取步驟j的損傷神經元，接種于含小膠質細胞的培養(yǎng)板混合培養(yǎng)，形成原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系。

3.根據(jù)權利要求2所述的原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，完全培養(yǎng)基的組分為DMEM/F12 75～90％，胎牛血清10～25％；混合培養(yǎng)基為新鮮完全培養(yǎng)基和原培養(yǎng)基按1:1混合。

4.根據(jù)權利要求2所述的原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，步驟i中神經元凋亡率為(23.9±2.5)％。

5.根據(jù)權利要求2所述的原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，步驟j中小膠質細胞和神經元細胞的純度均≥95％。

6.根據(jù)權利要求2所述的原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，步驟k中接種體系小膠質細胞密度與損傷神經元密度為10:1。

7.權利要求1或2所述的原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系在促進神經再生中的應用。

8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，原代小膠質細胞/損傷神經元共培養(yǎng)體系中加入促進神經再生的藥物含藥血清培養(yǎng)后，小膠質細胞吞噬指數(shù)增高250％～400％，神經元一級突起數(shù)量增加120％～160％，神經元一級突起平均長度增加100％～200％。