[發明專利]制備ROSA26基因突變及富含不飽和脂肪酸動物的方法

在審

• 申請號: 201810038598.1
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108192928A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 吳曉潔;王友亮;潘登科;郗永義;林艷麗;鐘榮斌;陳紅星
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了制備ROSA26基因突變及富含不飽和脂肪酸動物的方法。本發明公開的突變ROSA26基因的方法采用CRISPR/Cas9系統進行，CRISPR/Cas9系統包括靶向ROSA26基因的sgRNA，sgRNA的靶序列為序列表中序列2的核苷酸序列；該方法通過向受體細胞中導入sgRNA和Cas9以及含有Sfat1基因表達盒的供體DNA實現ROSA26基因的突變。實驗證明，利用本發明的方法可以成功敲除ROSA26基因，并定點整合Sfat1基因，最終成功得到表達Sfat1的動物。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中，制備ROSA26基因突變及富含不飽和脂肪酸動物的方法。

背景技術

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是一類被廣泛研究和關注的脂肪酸。PUFAs主要包括ω-6和ω-3PUFAs兩種類型，每一種類型都包括多個從短碳鏈(18C)到長碳鏈(22C)的、且含有多個不飽和鍵的脂肪酸。越來越多的研究證明，PUFAs具有廣泛的生物學功能，它們參與細胞膜的構成并作為許多細胞應答過程中的信號分子，與人類的多種疾病的發生緊密相關，其適宜的含量對于人類及其他哺乳動物的正常發育和保持良好的健康狀況極其重要。ω-6PUFAs從總體上來說對人體意義不大，其過量的攝入反而危害人體健康。ω-3PUFAs已經被證實在預防和治療心血管疾病、關節炎、癌癥等多種疾病方面有著重要作用。其中特別是22碳六烯的DHA和20碳五烯的EPA，對人體健康具有重要的積極意義。

通過轉基因技術在豬肉中生產ω-3PUFAs是目前優質豬育種的一個熱點和方向。ω-3脂肪酸去飽和酶基因是ω-3PUFAs合成的關鍵基因，它們利用ω-6PUFAs為底物在脂肪酸碳鏈甲基端第三個碳催化生成一個不飽和鍵(烯鍵)而合成相應的ω-3PUFAs。近年來，各國的科學家克隆了多個ω-3脂肪酸去飽和酶基因，但其中大部分基因只能合成18碳的ω-3PUFAs，開發利用價值不大。雖然也有報道能夠合成更長鏈的ω-3PUFAs基因，如真菌Saprolegnia diclina的ω-3脂肪酸去飽和酶能夠合成20碳的ω-3PUFAs，另一種真菌Mortierella alpina的1S-4不但能夠合成20碳的ω-3PUFAs，還能合成18碳的ω-3PUFAs。真正被用于此類研究的基因是來自于線蟲C.elegans的ω-3脂肪酸去飽和酶基因(Fat1)。該基因被轉入哺乳動物細胞以及小鼠中能使從18碳到22碳的ω-3PUFAs的含量增加，顯示出來很大的可開發利用價值。來自于線蟲C.briggasae的ω-3脂肪酸去飽和酶基因Sfat1(similar to Fat1)，可打通ω-6向ω-3多不飽和脂肪酸轉化的途徑，制備的隨機整合Sfat1轉基因克隆豬，ω-3脂肪酸的含量有大幅度提高，Sfat1轉基因豬肌肉組織中20碳的EPA約占總脂肪酸含量的16％，22碳的DHA約占總脂肪酸含量的4％。轉入Sfat1基因構建轉基因克隆豬是制備富含ω-3多不飽和脂肪酸轉基因豬的有效手段。

迄今為止豬胚胎干細胞尚未成功建系，利用誘導多能干細胞技術制備的豬誘導多能干細胞并不具有生殖系嵌合能力，制備基因修飾豬主要依賴于體細胞基因修飾和體細胞核移植技術。目前，體細胞的基因修飾主要有宿主基因定點整合和外源基因隨機插入兩種方法。利用常規載體、轉座子載體或病毒載體將目的基因整合到宿主基因組中，其整合過程屬隨機過程，目的基因整合在宿主基因組中的位置與拷貝數不可控。利用隨機轉基因主要存在以下問題：(1)外源基因整合宿主基因組位置不可控，有可能對宿主基因造成破壞，尤其是使用轉座子載體和病毒載體時其更偏向于整合到宿主轉錄活性區；(2)外源基因在宿主基因組中的拷貝數不確定，所獲得的基因修飾動物在傳代過程中基因型不一致；(3)外源基因的隨機整合導致其在宿主各個組織以及個體之間表達差異及個體表型不一；(4)外源基因的隨機插入，尤其是利用病毒載體時其外源基因啟動子容易被甲基化，造成外源基因沉默。這些缺點嚴重制約了基因修飾豬的培育與應用。