[發(fā)明專(zhuān)利]制備ROSA26基因突變及富含不飽和脂肪酸動(dòng)物的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810038598.1
• 申請(qǐng)日: 2018-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108192928A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳曉潔;王友亮;潘登科;郗永義;林艷麗;鐘榮斌;陳紅星
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/90;C12N9/22;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

1.突變ROSA26基因的方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行，所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括靶向ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列為如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列2的核苷酸序列；

A2)與A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；

A3)在嚴(yán)格條件下與A1)限定的DNA序列雜交的由A1)衍生的DNA序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括向受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述sgRNA和Cas9，實(shí)現(xiàn)ROSA26基因的突變。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述向受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述sgRNA和Cas9通過(guò)將含有所述sgRNA的編碼基因的表達(dá)載體和含有Cas9的編碼基因的表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述含有所述sgRNA的編碼基因的表達(dá)載體和所述含有Cas9的編碼基因的表達(dá)載體為同一個(gè)載體，將該載體命名為載體1，所述載體1為通過(guò)BsmB I向CRISPR/Cas9載體中插入序列2所示的DNA片段得到的重組載體，所述載體1能表達(dá)權(quán)利要求1所述的sgRNA和Cas9。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法還包括向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入供體DNA，實(shí)現(xiàn)ROSA26基因的突變，所述供體DNA含有ROSA26基因中位于所述靶序列上下游的兩個(gè)DNA片段。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述供體DNA還含有Sfat1編碼基因或Sfat1編碼基因的表達(dá)盒。

7.下述1)-6)中任一方法：

1)制備ROSA26基因突變細(xì)胞的方法，包括：利用權(quán)利要求1-6中任一所述的方法制備得到ROSA26基因突變的細(xì)胞；

2)制備ROSA26基因突變動(dòng)物的方法，包括：利用權(quán)利要求1-6中任一所述的方法制備ROSA26基因突變的動(dòng)物細(xì)胞，利用所述ROSA26基因突變的動(dòng)物細(xì)胞制備ROSA26基因突變動(dòng)物；

3)制備表達(dá)Sfat1細(xì)胞的方法，包括：利用權(quán)利要求6中所述的方法制備ROSA26基因突變的動(dòng)物細(xì)胞，得到表達(dá)Sfat1的細(xì)胞；

4)制備表達(dá)Sfat1動(dòng)物的方法，包括：利用權(quán)利要求6中所述的方法制備ROSA26基因突變的動(dòng)物細(xì)胞，得到表達(dá)Sfat1的細(xì)胞；利用所述表達(dá)Sfat1的細(xì)胞制備表達(dá)Sfat1的動(dòng)物；

5)制備富含不飽和脂肪酸細(xì)胞的方法，包括：利用權(quán)利要求6中所述的方法制備ROSA26基因突變的動(dòng)物細(xì)胞，得到富含不飽和脂肪酸的細(xì)胞；

6)制備富含不飽和脂肪酸動(dòng)物的方法，包括：利用權(quán)利要求6中所述的方法制備ROSA26基因突變的動(dòng)物細(xì)胞，得到表達(dá)Sfat1的細(xì)胞；利用所述表達(dá)Sfat1的細(xì)胞制備富含不飽和脂肪酸的動(dòng)物。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述細(xì)胞為下述a1)或a2)或a3)：

a1)動(dòng)物細(xì)胞；

a2)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；

a3)豬細(xì)胞；

所述動(dòng)物為b1)或b2)：

b1)哺乳動(dòng)物；

a2)豬。

9.權(quán)利要求7或8所述方法中所述制備ROSA26基因突變細(xì)胞的方法得到的細(xì)胞或所述制備表達(dá)Sfat1細(xì)胞的方法得到的細(xì)胞或所述制備富含不飽和脂肪酸細(xì)胞的方法得到的細(xì)胞。

10.權(quán)利要求1-9中任一所述方法在動(dòng)物育種中的應(yīng)用。