[發明專利]一種海水魚腌制過程細菌群落多樣性的分析方法

在審

• 申請號: 201810037183.2
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN107974493A
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 孫瑛
• 申請（專利權）人: 舟山市食品藥品檢驗檢測研究院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司33246
• 代理人: 賈森君

技術領域

本發明屬于水產品深加工領域，具體涉及一種海水魚腌制過程細菌群落多樣性的分析方法。

背景技術

中國是水產品生產和貿易大國，水產品總產量自1989年起連續位居世界第一位，占世界總產量的1/3，2010年水產品總產量更是超過5270萬噸。浙江省是海洋大省，海產品種類極其豐富，且深受當地民眾的喜愛。由于海產品中含有豐富的營養物質和水分，加之肌肉組織脆弱、內源性蛋白酶活躍、自溶速度快等因素，海產品在較短的時間內易發生物理、化學和微生物等方面的變化，從而導致產品腐敗，失去食用價值。腌制海產品是一種傳統的加工保藏產品，其不僅保存了海產品豐富的營養價值，且具有獨特的口感和風味，深受大眾的喜愛，具有非常廣泛的市場需求。腌制過程是以食鹽為主要輔料，在海產品表面直接撒上適量的固體食鹽(干腌法)或者將海產品浸入食鹽水中(濕腌法)。海產品通過腌制能抑制腐敗菌生長，從而提高食品的防腐性能，延長保質期，改善產品風味。

浙江東南沿海地區食用腌制水產品非常普遍，尤其是腌制海產品，例如咸帶魚、咸黃魚、咸鰳魚等產品。但長期以來人們對腌制海產品的食用安全性缺乏認識，如腌制條件控制不當會使亞硝酸鹽含量超標，有害菌群的大量繁殖會危害人體健康。針對南方鼻咽癌和胃癌發病率較高的現象，許多學者對沿海地區的海產品進了硝酸鹽、亞硝酸鹽、亞硝胺的含量調查，結果從腌制水產品中檢測到了不同水平的致癌物質亞硝胺，其中以揮發性二甲基亞硝胺最為常見。亞硝胺是一種很強的致癌物質，已檢測的300種亞硝胺類化合物中已證實90％至少可誘導一種動物致癌。亞硝胺的產生，是因為新鮮魚類等水產品在進行腌制、烘烤等加工處理時分解出較多的胺類化合物，胺類化合物在亞硝酸鹽等亞硝化試劑存在時即可生成亞硝胺。腌制海產品中所含的硝酸鹽和亞硝酸鹽主要為產地環境以及腌制所用粗鹽帶入。海產品腌制過程中作用的細菌菌群種類復雜多樣，部分菌群能把硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，為亞硝胺形成提供前體物質。海產品腌制過程中作用的細菌菌群種類復雜多樣，有害菌群的大量繁殖會危害人體健康。普通的培養法不能完全反應菌群種類的多樣性，很多菌群無法用傳統培養的方法生長。

因此，有必要研究海產品腌制過程中細菌群落的多樣性及其變化，為腌制海產品的食用安全性、品質控制等提供理論依據。

發明內容

本發明目的是提供一種海水魚腌制過程細菌群落多樣性的分析方法，解決上述問題。

本發明的技術方案是：

一種海水魚腌制過程細菌群落多樣性的分析方法，該方法包括如下步驟：

(1)海水魚的腌制：以新鮮的海捕魚為原料，鹽與魚的重量比為1:4或1:8，在室溫25℃的條件下，分別腌制5d、10d、15d、20d；

(2)樣品總DNA提取：取0d、5d、10d、15d、20d的腌制海水魚分別制成魚與水的重量比為1:10的樣品液，取所述樣品液5mL進行總DNA的提取，制得多個DNA樣本。

(3)以所述DNA樣本進行PCR擴增和16S rDNA基因克隆文庫的構建后進行測序。

(4)將測得序列在GeneBank數據庫中進行BLAST同源性比對，分析出克隆所屬物種的系統位置和種類。

進一步的，步驟(3)中所述PCR擴增的反應體系為：10×Buffer2.5μL、dNTP 1μL、DreamTaq-TM DNA聚合酶0.2μL、上下游引物各0.5μL、模板DNA0.5μL，用無菌ddH₂O補足25μL體系。

進一步的，步驟(3)中所述PCR擴增的循環條件為：先在94℃的溫度條件下預變性4min；再按94℃變性45S，55℃退火45S，72℃延伸1min的方式進行30個循環；最后在72℃的溫度條件下修復延伸10min。

進一步的，步驟(3)中所述PCR擴增的產物回收過程為：采用1％瓊脂糖電泳，150V、100mA 20min電泳觀察，PCR產物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，采用純化試劑盒對目的條帶進行純化回收，從而得到純化后的PCR產物。