[發(fā)明專利]一種海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810037183.2 | 申請日： | 2018-01-15 |
| 公開（公告）號： | CN107974493A | 公開（公告）日： | 2018-05-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 孫瑛 | 申請（專利權(quán)）人： | 舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 |
| 主分類號： | C12Q1/6869 | 分類號： | C12Q1/6869;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 杭州千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司33246 | 代理人： | 賈森君 |
| 地址： | 316021 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 海水 腌制 過程 細(xì)菌 群落 多樣性 分析 方法 | ||
1.一種海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：
(1)海水魚的腌制：以新鮮的海捕魚為原料，鹽與魚的重量比為1:4或1:8，在室溫25℃的條件下，分別腌制5d、10d、15d、20d；
(2)樣品總DNA提取：取0d、5d、10d、15d、20d的腌制海水魚分別制成魚與水的重量比為1:10的樣品液，取所述樣品液5mL進(jìn)行總DNA的提取，制得多個DNA樣本；
(3)以所述DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和16S rDNA基因克隆文庫的構(gòu)建后進(jìn)行測序；
(4)將測得序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，分析出克隆所屬物種的系統(tǒng)位置和種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10×Buffer2.5μL、dNTP 1μL、DreamTaq-TM DNA聚合酶0.2μL、上下游引物各0.5μL、模板DNA0.5μL，用無菌ddH2O補(bǔ)足25μL體系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件為：先在94℃的溫度條件下預(yù)變性4min；再按94℃變性45S，55℃退火45S，72℃延伸1min的方式進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72℃的溫度條件下修復(fù)延伸10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物回收過程為：采用1％瓊脂糖電泳，150V、100mA 20min電泳觀察，PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，采用純化試劑盒對目的條帶進(jìn)行純化回收，從而得到純化后的PCR產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述16S rDNA基因克隆文庫的構(gòu)建后進(jìn)行測序包括：按Takara18-T Vector連接試劑盒操作將純化后的PCR產(chǎn)物與18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109。將連接轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在預(yù)先用20μl 100mmol/L IPTG和100μl 20mg/ml X-gal涂布的氨芐青霉素平板上于37℃培養(yǎng)過夜；按SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒操作提取質(zhì)粒，用引物M13+和M13-進(jìn)行擴(kuò)增測序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：步驟(4)中克隆所屬物種的種類具體為：在重量比為1:4的鹽魚比條件下所腌制海水魚，在0d的優(yōu)勢菌屬為芽胞梭菌屬，占比為53％，假單胞菌屬，占比30％；在5d的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為77％；在10d的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬，占比為47％，嗜冷桿菌屬，占比為37％；在15d的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為67％；在20d的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為77％。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：在0d的優(yōu)勢菌種為腐化芽胞梭菌和莓實(shí)假單胞菌、在5d的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在10d的優(yōu)勢菌種為熒光假單胞菌和養(yǎng)料嗜冷桿菌、在15d的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在20d的優(yōu)勢菌種為Psychrobacter sp.P2-18(2011)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：步驟(4)中克隆所屬物種的種類具體為：在重量比為1:8的鹽魚比條件下所腌制海水魚，在0d的優(yōu)勢菌屬為芽胞梭菌屬，占比為83％；在5d的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為70％；在10d的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為93％；在15d的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為90％；在20d的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為77％。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：在0d的優(yōu)勢菌種為解朊梭菌、在5d的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在10d的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在15d的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在20d的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌。
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