[發(fā)明專利]一種海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810037183.2
• 申請(qǐng)日: 2018-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107974493A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫瑛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司33246
• 代理人: 賈森君

1.一種海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)海水魚(yú)的腌制：以新鮮的海捕魚(yú)為原料，鹽與魚(yú)的重量比為1:4或1:8，在室溫25℃的條件下，分別腌制5d、10d、15d、20d；

(2)樣品總DNA提?。喝?d、5d、10d、15d、20d的腌制海水魚(yú)分別制成魚(yú)與水的重量比為1:10的樣品液，取所述樣品液5mL進(jìn)行總DNA的提取，制得多個(gè)DNA樣本；

(3)以所述DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和16S rDNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建后進(jìn)行測(cè)序；

(4)將測(cè)得序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，分析出克隆所屬物種的系統(tǒng)位置和種類。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10×Buffer2.5μL、dNTP 1μL、DreamTaq-TM DNA聚合酶0.2μL、上下游引物各0.5μL、模板DNA0.5μL，用無(wú)菌ddH₂O補(bǔ)足25μL體系。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件為：先在94℃的溫度條件下預(yù)變性4min；再按94℃變性45S，55℃退火45S，72℃延伸1min的方式進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72℃的溫度條件下修復(fù)延伸10min。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物回收過(guò)程為：采用1％瓊脂糖電泳，150V、100mA 20min電泳觀察，PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，采用純化試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行純化回收，從而得到純化后的PCR產(chǎn)物。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于，步驟(3)中所述16S rDNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建后進(jìn)行測(cè)序包括：按Takara18-T Vector連接試劑盒操作將純化后的PCR產(chǎn)物與18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109。將連接轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在預(yù)先用20μl 100mmol/L IPTG和100μl 20mg/ml X-gal涂布的氨芐青霉素平板上于37℃培養(yǎng)過(guò)夜；按SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒操作提取質(zhì)粒，用引物M13+和M13-進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：步驟(4)中克隆所屬物種的種類具體為：在重量比為1:4的鹽魚(yú)比條件下所腌制海水魚(yú)，在0d的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽胞梭菌屬，占比為53％，假單胞菌屬，占比30％；在5d的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為77％；在10d的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬，占比為47％，嗜冷桿菌屬，占比為37％；在15d的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為67％；在20d的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為77％。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：在0d的優(yōu)勢(shì)菌種為腐化芽胞梭菌和莓實(shí)假單胞菌、在5d的優(yōu)勢(shì)菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在10d的優(yōu)勢(shì)菌種為熒光假單胞菌和養(yǎng)料嗜冷桿菌、在15d的優(yōu)勢(shì)菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在20d的優(yōu)勢(shì)菌種為Psychrobacter sp.P2-18(2011)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：步驟(4)中克隆所屬物種的種類具體為：在重量比為1:8的鹽魚(yú)比條件下所腌制海水魚(yú)，在0d的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽胞梭菌屬，占比為83％；在5d的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為70％；在10d的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為93％；在15d的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為90％；在20d的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌屬，占比為77％。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的海水魚(yú)腌制過(guò)程細(xì)菌群落多樣性的分析方法，其特征在于：在0d的優(yōu)勢(shì)菌種為解朊梭菌、在5d的優(yōu)勢(shì)菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在10d的優(yōu)勢(shì)菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在15d的優(yōu)勢(shì)菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌、在20d的優(yōu)勢(shì)菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌。