[發(fā)明專利]一種可調(diào)控基因表達(dá)的人類胚胎干細(xì)胞系及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810036648.2
• 申請(qǐng)日: 2018-01-15
• 公開（公告）號(hào): CN108559731A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 榮知立;林瑛;馬淑鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/113;C12N15/63;C12N15/90
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 郝文婷;劉明星

本發(fā)明公開了一種可調(diào)控基因表達(dá)的人類胚胎干細(xì)胞系及其應(yīng)用。本發(fā)明可調(diào)控基因表達(dá)的人類胚胎干細(xì)胞系包含可控表達(dá)外源性融合蛋白系統(tǒng)和至少一種向?qū)NA，所述可控表達(dá)外源性融合蛋白系統(tǒng)包括四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和以Cas9蛋白和具有轉(zhuǎn)錄激活活性的p300核心結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的融合蛋白；所述向?qū)NA為靶向基因啟動(dòng)子區(qū)的14bp短序列或針對(duì)基因組區(qū)域的20bp的長序列。本發(fā)明可實(shí)時(shí)控制Cas9?p300在人類胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)在人類胚胎干細(xì)胞分化的不同階段特定基因激活和切割雙功能，大大的擴(kuò)展了人類胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的可控性激活切割雙系統(tǒng)的Cas9-p300人類胚胎干細(xì)胞系及其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人類胚胎干細(xì)胞是一種多潛能性細(xì)胞，來自早期胚胎(4-5d)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有自我更新和多向分化的潛能。1998年，美國科學(xué)家James Thomson首次體外成功培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞，人類胚胎干細(xì)胞的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用也拉開的帷幕。目前研究中，胚胎干細(xì)胞已經(jīng)成功的分化成滋養(yǎng)層細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞，也成功的建立了個(gè)體發(fā)育模型，同時(shí)正在向干細(xì)胞的移植來重建機(jī)體功能和干細(xì)胞基因治療等臨床治療方向努力發(fā)展，雖然胚胎干細(xì)胞的研究前景令人很樂觀，但是也存在很多困難，如細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)條件要求高，資金消耗大等問題。

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated systems)，全名是常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)，是細(xì)菌及古生菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，能夠通過單鏈RNA識(shí)別外源雙鏈DNA，并借助Cas9核酸酶切割外源DNA，抵御外源DNA侵襲。2013年，張鋒等科學(xué)家首次報(bào)道了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物基因組編輯中的應(yīng)用，開啟了CRISPR-Cas9強(qiáng)大的基因編輯功能成為生命科學(xué)領(lǐng)域的新星，獲得廣泛研究和應(yīng)用，近些年針對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的成份進(jìn)行不同的修飾和更改，如突變Cas9中活性區(qū)的重要的氨基酸和縮短向?qū)NA的長度，來控制Cas9核酸酶是切割活性。

非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR)，是機(jī)體DNA受到損傷時(shí)常見的DNA修復(fù)機(jī)制，其中，NHEJ為主，HDR為輔，目前，基因敲入方法主要是基于后者HDR機(jī)制，此方法具有精確基因編輯的效果，但是存在效率低問題，當(dāng)在大規(guī)模進(jìn)行基因敲入時(shí)，這將給實(shí)驗(yàn)帶來很大不方便，因此NHEJ是我們實(shí)驗(yàn)所關(guān)注的重點(diǎn)。定點(diǎn)在AAVS1位點(diǎn)進(jìn)行外源基因的敲入，在即往的研究中已證明不影響整個(gè)細(xì)胞的生理過程和機(jī)制功能，因此我們利用CRISPR-Cas9核酸酶在AAVS1位點(diǎn)進(jìn)行切割，利用機(jī)體的自身的NHEJ修復(fù)機(jī)制進(jìn)行基因敲入，發(fā)現(xiàn)效率可觀。

P300蛋白具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，可使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)，暴露基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子于轉(zhuǎn)錄因子，起到調(diào)控基因的表達(dá).有報(bào)導(dǎo)指出p300蛋白的基因激活作用效果優(yōu)于VP64 等相似功能蛋白，但其在基因修飾領(lǐng)域的應(yīng)用仍少于VP64等傳統(tǒng)作用因子。本發(fā)明將 Cas9-p300基因定點(diǎn)敲入人類胚胎干細(xì)胞的AAVS1位點(diǎn)，結(jié)合四環(huán)素(DOX)誘導(dǎo)控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)控制Cas9-p300在人類胚胎干細(xì)胞的特定階段表達(dá)，實(shí)現(xiàn)特定基因激活和切割雙功能，可在人類胚胎干細(xì)胞分化的不同階段實(shí)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)基因的激活或切割，或者基因激活和切割同時(shí)實(shí)現(xiàn)，從而擴(kuò)大了人類胚胎干細(xì)胞應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：提供一種可控性表達(dá)Cas9-p300融和蛋白的人類胚胎干細(xì)胞系及其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。