[發明專利]一種可調控基因表達的人類胚胎干細胞系及其應用

在審

• 申請號: 201810036648.2
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108559731A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 榮知立;林瑛;馬淑鳳
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N15/63;C12N15/90
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 郝文婷;劉明星

本發明公開了一種可調控基因表達的人類胚胎干細胞系及其應用。本發明可調控基因表達的人類胚胎干細胞系包含可控表達外源性融合蛋白系統和至少一種向導RNA，所述可控表達外源性融合蛋白系統包括四環素誘導表達系統和以Cas9蛋白和具有轉錄激活活性的p300核心結構域構成的融合蛋白；所述向導RNA為靶向基因啟動子區的14bp短序列或針對基因組區域的20bp的長序列。本發明可實時控制Cas9?p300在人類胚胎干細胞中表達，實現在人類胚胎干細胞分化的不同階段特定基因激活和切割雙功能，大大的擴展了人類胚胎干細胞在醫學和生命科學領域中的應用。

技術領域

本發明屬于基因工程和生物技術領域，涉及由CRISPR/Cas9介導的可控性激活切割雙系統的Cas9-p300人類胚胎干細胞系及其構建方法及其應用。

背景技術

人類胚胎干細胞是一種多潛能性細胞，來自早期胚胎(4-5d)的內細胞團，具有自我更新和多向分化的潛能。1998年，美國科學家James Thomson首次體外成功培養人類胚胎干細胞，人類胚胎干細胞的科學研究和臨床應用也拉開的帷幕。目前研究中，胚胎干細胞已經成功的分化成滋養層細胞、神經細胞、肝細胞、軟骨細胞、造血細胞、心肌細胞等多種細胞，也成功的建立了個體發育模型，同時正在向干細胞的移植來重建機體功能和干細胞基因治療等臨床治療方向努力發展，雖然胚胎干細胞的研究前景令人很樂觀，但是也存在很多困難，如細胞培養技術條件要求高，資金消耗大等問題。

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated systems)，全名是常間回文重復序列叢集/常間回文重復序列叢集關聯蛋白系統，是細菌及古生菌的一種獲得性免疫系統，能夠通過單鏈RNA識別外源雙鏈DNA，并借助Cas9核酸酶切割外源DNA，抵御外源DNA侵襲。2013年，張鋒等科學家首次報道了CRISPR-Cas9系統在哺乳動物基因組編輯中的應用，開啟了CRISPR-Cas9強大的基因編輯功能成為生命科學領域的新星，獲得廣泛研究和應用，近些年針對CRISPR-Cas9系統中的成份進行不同的修飾和更改，如突變Cas9中活性區的重要的氨基酸和縮短向導RNA的長度，來控制Cas9核酸酶是切割活性。

非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(HDR)，是機體DNA受到損傷時常見的DNA修復機制，其中，NHEJ為主，HDR為輔，目前，基因敲入方法主要是基于后者HDR機制，此方法具有精確基因編輯的效果，但是存在效率低問題，當在大規模進行基因敲入時，這將給實驗帶來很大不方便，因此NHEJ是我們實驗所關注的重點。定點在AAVS1位點進行外源基因的敲入，在即往的研究中已證明不影響整個細胞的生理過程和機制功能，因此我們利用CRISPR-Cas9核酸酶在AAVS1位點進行切割，利用機體的自身的NHEJ修復機制進行基因敲入，發現效率可觀。

P300蛋白具有組蛋白乙酰轉移酶活性，可使染色質結構重構，暴露基因的啟動子和增強子于轉錄因子，起到調控基因的表達.有報導指出p300蛋白的基因激活作用效果優于VP64 等相似功能蛋白，但其在基因修飾領域的應用仍少于VP64等傳統作用因子。本發明將 Cas9-p300基因定點敲入人類胚胎干細胞的AAVS1位點，結合四環素(DOX)誘導控制系統，實現實時控制Cas9-p300在人類胚胎干細胞的特定階段表達，實現特定基因激活和切割雙功能，可在人類胚胎干細胞分化的不同階段實現單個或多個基因的激活或切割，或者基因激活和切割同時實現，從而擴大了人類胚胎干細胞應用。

發明內容

本發明的目的在于：提供一種可控性表達Cas9-p300融和蛋白的人類胚胎干細胞系及其構建方法及其應用。