[發明專利]一種可調控基因表達的人類胚胎干細胞系及其應用

在審

• 申請號: 201810036648.2
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108559731A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 榮知立;林瑛;馬淑鳳
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N15/63;C12N15/90
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 郝文婷;劉明星

1.一種可調控基因表達的人類胚胎干細胞系，其特征在于，包含可控表達外源性融合蛋白系統和至少一種向導RNA，所述可控表達外源性融合蛋白系統包括四環素誘導表達系統和以Cas9蛋白和具有轉錄激活活性的p300核心結構域構成的融合蛋白；所述向導RNA為靶向基因啟動子區的14bp短序列或針對基因組區域的20bp的長序列。

2.根據權利要求1所述的可調控基因表達的人類胚胎干細胞系，其特征在于，所述基因啟動子區位于MYOD1、IL1RN、HBG1、FOXA2、SOX17、NKX2.1和miR145。

3.根據權利要求1所述的可調控基因表達的人類胚胎干細胞系，其特征在于，所述基因組區域位于CCR5、IL1RN、HBG1和OCT4。

4.一種供體表達載體，其特征在于，該表達載體用于表達權利要求1所述的可控表達外源性融合蛋白系統。

5.根據權利要求4所述的供體表達載體，其特征在于，其包括以下四個部分：

第一部分，控制系統元件，包括CMV啟動子，M2rtTA表達序列，SV40polyA；

第二部分，融和蛋白表達元件，包括TRE啟動子，Cas9-p300表達序列，SV40polyA；

第三部分，體內線性化元件，包括位于供體載體兩端方向相同的23bp的AAVS1gRNA識別序列；

第四部分，抗性篩選元件，包括T2A，puromycin抗性基因表達序列，bGH polyA。

6.權利要求1所述的可調控基因表達的人類胚胎干細胞系的構建方法，其特征在于，通過CRISPR-CAS9切割基因組AAVS1位點和供體載體兩端AAVS1位點，并利用非同源末端直接連接把權利要求4或5所述供體表達載體敲入基因組AAVS1位點。

7.根據權利要求6所述的可控表達外源性融合蛋白系統的構建方法，其特征在于，體內線性化的外源基因無需同源臂直接敲入基因組AAVS1位點上。

8.權利要求1或2或3所述的可調控基因表達的人類胚胎干細胞系在DNA靶向激活/切割中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將可控表達外源性融合蛋白系統敲入人類胚胎干細胞系；

(2)構建表達向導RNA的載體，包括長向導RNA和/或短向導RNA；

(3)加入四環素，誘導步驟(1)所得人類胚胎干細胞系中Cas9-p300表達；

(4)將步驟(2)所得表達向導RNA的載體通過電轉轉入步驟(1)所得人類胚胎干細胞系，細胞內表達的融合蛋白與向導RNA結合，將Cas9-p300融合蛋白靶向目標基因區，實現基因的激活和/或切割。

10.權利要求1或2或3所述可調控基因表達的人類胚胎干細胞系在人類胚胎干細胞分化中的應用。