[發明專利]一種抗牛早孕因子單克隆抗體細胞株單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201810036346.5
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108314732A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 陸建;鄭慶豐;信維力
• 申請（專利權）人: 妊達（北京）生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K1/22;C12N5/20;G01N33/68;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 北京紐樂康知識產權代理事務所(普通合伙) 11210
• 代理人: 史靜

本發明公開了一種抗牛早孕因子單克隆抗體細胞株單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：合成抗體位點序列多肽，并偶聯載體蛋白，采用B細胞雜交瘤技術建立一種抗牛早孕因子單克隆抗體細胞株，偶聯產物免疫的BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞融合，經陽性雜交瘤細胞篩選、細胞克隆獲得能穩定傳代并分泌抗牛早孕單克隆抗體的雜交瘤細胞；用構建的雜交瘤細胞對BALB/C小鼠進行腹腔注射，制備腹水單克隆抗體。本發明提供的抗牛早孕因子單克隆抗體細胞株及抗牛早孕因子單克隆抗體，為牛早期妊娠的快速檢測提供服務。

技術領域

本發明涉及細胞工程技術領域，具體來說涉及B細胞雜交瘤技術，更具體地，涉及一種抗牛早孕因子單克隆抗體細胞株單克隆抗體的制備方法。

背景技術

對牛精準及時的懷孕檢測在當今的牧場繁殖管理程序中是一項十分重要的內容。獸醫和牧場工作人員對牛進行早期懷孕檢測，篩查出空懷牛(沒有懷孕的牛)，這樣的工作可以盡快重配空懷牛以及縮短產犢間隔，從而為牧場帶來最高的牛奶產量和收益。

目前，通過對牛進行直腸觸診(PPR)或超聲(TU)來診斷牛是否懷孕，是篩查空懷牛的主要方法。這兩種方法各有利弊：直腸觸診，是獸醫最常用的奶牛妊娠診斷方法之一，主要根據觸摸到的生殖器官的形態變化來確認。有經驗的獸醫最早可以在第35天通過直腸觸診來確定奶牛是否妊娠。這種方式最大的缺點是需要耗費大量人力，同時還可能會觸及子宮和胎膜對早期胚胎造成傷害，破壞母牛直腸組織甚至導致胚胎丟失。此外，要熟練掌握直腸觸診手法困難很大，并有感染人畜共患病(牛布氏桿菌病等)的風險；超聲波檢測是利用超聲波的物理特征，不同的子宮組織會出不同的回聲，從而確定胚胎是否存在，并就此進行妊娠診斷。與直腸觸診相比有很多優點，包括準確率高、妊娠診斷早、可判斷胎兒的活力等等。但這種方法需要購置昂貴的儀器，熟練診斷也需要大量的訓練，同時超聲波檢測對早期胚胎也有一定損傷，造成胚胎早期流失。

牛早孕因子是牛胎盤滋養層細胞表達出的一類蛋白物質，從外周血液中測定這種蛋白可以確定是否有胚胎著床，從而判斷母牛是否妊娠。在牛妊娠的第 22天，妊娠母牛和非妊娠母牛體內的牛早孕因子濃度有了顯著差別，這是牛早孕因子進行早期妊娠診斷的理論依據。制備這種早孕因子抗體，利用抗體的高特異性、高靈敏性建立高特異性高靈敏度免疫檢測方法，精準進行早期妊娠檢測。這種檢測具有很高的準確性，其不懷孕檢出率高達99％，懷孕檢出率97％ (這包括妊娠后期的意外流產)，同時避免了對早期胚胎的損傷，也最大可能的避免了人畜共患病的感染，保護相關從業人員的安全。

一種可以精準檢測懷孕的實驗室檢測方法，可以早在牛配種后28天檢測到牛是否懷孕，為獸醫和奶牛場的工作人員提供檢測懷孕牛的重要工具。

發明內容

本發明的目的在于：獲得建立動物(特別是牛)早孕免疫檢測方法不可缺少的高質量單克隆抗體細胞株，從而制備早孕因子單克隆抗體，最終開發出能夠快速、準確檢測動物(特別是牛)早孕的免疫檢測產品。

本發明的目的通過以下技術方案實施：

分析牛早孕因子氨基酸序列，確定其可能的抗體位點，合成多肽并將多肽交聯于大分子蛋白載體KLH，采用多肽-KLH交聯物免疫Balb/c小鼠，通過B細胞雜交瘤技術，經過動物免疫、細胞融合、篩選(BSA交聯物用于單抗的篩選) 及亞克隆，獲得可以穩定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，并制備腹水，Protein G親和純化特異性抗體。

本發明的特點在于：一、采用混合多肽免疫動物，制備單抗，鑒定單抗反應多肽。二、采用與不同多肽反應的抗體，ELISA雙抗體夾心法配對檢測蛋白。

基于本發明，通過棋盤法評價抗體配對檢測牛早孕因子，對可以配對的抗體進行實驗條件的優化。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹。