[發(fā)明專利]以CD20為靶點(diǎn)的特異性抗體、CAR-NK細(xì)胞及其制備和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810036244.3
• 申請(qǐng)日: 2018-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108285486A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李華順
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江阿思科力生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/28
• 分類號(hào): C07K16/28;C07K19/00;C12N15/13;C12N15/62;C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京布瑞知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11505
• 代理人: 孟潭

本發(fā)明提供一種以CD20為靶點(diǎn)的抗CD20抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括VH1鏈和/或VL1鏈和/或VH2鏈和/或VL2鏈，所述VH1鏈和/或VL1鏈和/或VH2鏈和/或VL2鏈之間直接連接或通過(guò)連接肽連接。本發(fā)明提供以CD20為靶點(diǎn)的抗CD20抗體或其抗原結(jié)合片段，并以此所構(gòu)建的Anti CD20 CAR?NK細(xì)胞為單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)并擴(kuò)增所得，性狀也穩(wěn)定，可用于大規(guī)模生產(chǎn)制備。Anti CD20 CAR?NK細(xì)胞以CD20分子為靶抗原，能夠特異性地殺死或殺傷淋巴瘤細(xì)胞，可作為淋巴瘤類疾病的治療藥物，用于CD20分子高表達(dá)的腫瘤的治療。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及以CD20為靶點(diǎn)的特異性抗體，以CD20為靶點(diǎn)的CAR-NK細(xì)胞及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，縮寫(xiě)CAR)修飾的免疫細(xì)胞使用遺傳工程手段修飾免疫細(xì)胞使其表達(dá)外源性抗腫瘤基因。CAR基因主要包括細(xì)胞外識(shí)別域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：前者用于識(shí)別腫瘤表面特異性分子和后者用于啟動(dòng)識(shí)別腫瘤表面分子后的免疫細(xì)胞應(yīng)答，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，其主要以T-細(xì)胞為載體。

CAR-T，全稱是Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)是將能識(shí)別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與CD3-ζ鏈或4-1BB等胞內(nèi)元件在體外偶聯(lián)為一個(gè)嵌合基因，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)。患者的T細(xì)胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的CAR-T細(xì)胞。

CD20抗原是一種B細(xì)胞分化抗原，僅位于前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞，它在95％以上的B細(xì)胞性淋巴瘤中表達(dá)，而在造血干細(xì)胞、血漿細(xì)胞和其他正常組織中不表達(dá)。以CD20為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的抗體藥物Rituximab在復(fù)發(fā)或耐藥的濾泡性中央型淋巴瘤的治療上取得了良好的療效。

目前大量的研究證明CD20可作為治療B細(xì)胞淋巴瘤的的靶點(diǎn)用于CAR的構(gòu)建。但制備CAR-T的T細(xì)胞只能來(lái)自患者自身，不能異體回輸，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本較高，不利于其大規(guī)模應(yīng)用。

自然殺傷(natural killer，縮寫(xiě)NK)細(xì)胞是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，先天免疫系統(tǒng)反應(yīng)的關(guān)鍵性介質(zhì)細(xì)胞。NK細(xì)胞是一種廣譜免疫細(xì)胞，具有快速發(fā)現(xiàn)和摧毀異常細(xì)胞(如癌癥或病毒感染的細(xì)胞)的特異功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示強(qiáng)大的溶解異常細(xì)胞的活性。使用NK細(xì)胞來(lái)治療癌癥是最新趨勢(shì)，這種新療法有望為對(duì)傳統(tǒng)手術(shù)、化療和放療無(wú)效的腫瘤提供了新的治愈希望。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種以CD20為靶點(diǎn)的抗CD20抗體或其抗原結(jié)合片段，以及能夠表達(dá)該結(jié)構(gòu)域的CAR-NK細(xì)胞及其制備和應(yīng)用，該細(xì)胞性狀穩(wěn)定，可大批量生產(chǎn)和制備，且可進(jìn)行異體回溯。

本發(fā)明一方面提供一種以CD20為靶點(diǎn)的抗CD20抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括VH1鏈和/或VL1鏈和/或VH2鏈和/或VL2鏈，所述VH1鏈和/或VL1鏈和/或VH2鏈和/或VL2鏈之間直接連接或通過(guò)連接肽連接。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述VH1鏈和/或VL1鏈和/或VH2鏈和/或VL2鏈，所述VH1鏈和/或VL1鏈和/或VH2鏈和/或VL2鏈之間通過(guò)連接肽連接。

示例性地，所述連接肽的序列為GGGGSGGGGSGGGGS。

示例性地，所述VH1鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的序列或其同源序列，和/或所述VL1鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列或其同源序列，和/或所述VH2鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列或其同源序列，和/或所述VL2鏈的氨基酸序列如SEQID NO：4所示的序列或其同源序列。