[發明專利]一種全基因組甲基化高通量測序方法

在審

• 申請號: 201810035958.2
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108034705A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 李澤卿
• 申請（專利權）人: 武漢愛基百客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明公開了一種全基因組甲基化高通量測序方法，包括如下步驟：將基因組測序樣本，連接上CCGG位點的接頭，隨后用MmeI酶切，在用連接酶連接上基因組測序樣本上的第二個接頭，將擴增后的基因組測序樣本使用PTP平板，且測序模板表面放置有ATP硫化酶以及熒光素酶，測序開始時，A、T、C、G四種堿基依照固定順序依次循環進行入PTP平板，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸結合形成ATP，在熒光素酶的催化下，生成的ATP和熒光素結合形成氧化熒光素，在反應所釋放的光信號被高靈敏度的CCD捕獲，并生成測序圖像。本發明能夠對基因組進行準確的測序，能夠將基因組序列顯示在我們眼前。

技術領域

本發明涉及基因測序技術領域，尤其涉及一種全基因組甲基化高通量測序方法。

背景技術

高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generationsequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規模平行簽名測序(Massively Parallel SignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸測序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序(Ion semiconductor sequencing)、DNA納米球測序(DNA nanoball sequencing)等。隨著現在科技的不斷進步，現有的測序方法已經滿足不了現在的發展速度。為此，我們提出了一種全基因組甲基化高通量測序方法。

發明內容

本發明提出了一種全基因組甲基化高通量測序方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

本發明提出了一種全基因組甲基化高通量測序方法，包括如下步驟：

S1：選取基因組，并利用限制性內切酶對基因組進行酶切，以便獲得基因組片段，并將獲取的基因組片段置于零下15-零下8攝氏度的條件下進行放置，放置環境需為無菌環境；

S2：在放置36-48h后，將基因組片段取出，并置于5-8攝氏度的環境中，然后將所述基因組片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的基因組片段，修復后的基因組片段再次放置在器皿內，并向器皿內添加亞硫酸鹽，且亞硫酸鹽需漫過基因組片段，并對基因組片段進行實時晃動，從而使其均勻接觸，待其放置4-7min后，則完成對基因組片段的修飾，從而形成基因組測序樣本；

S3：將S2中形成的基因組測序樣本，對樣本上的CCGG位點進行確定，然后連接上CCGG位點的接頭，隨后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位點的18-19bp的標簽序列，在用連接酶連接上基因組測序樣本上的第二個接頭，然后對其進行擴增，且擴增的溫度為25-35攝氏度；

S4：將S3中擴增后的基因組測序樣本使用PTP平板，且PTP平板含有160萬個光纖孔，在測序反應中，每個光纖孔內都固定有測序模板，且測序模板表面放置有ATP硫化酶以及熒光素酶，測序開始時，A、T、C、G四種堿基依照固定順序依次循環進行入PTP平板，且每次只進入一個堿基，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸結合形成ATP，在熒光素酶的催化下，生成的ATP和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光；

S5：在S4中反應所釋放的光信號被高靈敏度的CCD捕獲，并生成測序圖像，從而獲得待測模板的測序信息。

優選的，在S2中的修飾過程中，必須保證pH值的準確度。