[發(fā)明專利]一種全基因組甲基化高通量測序方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810035958.2 | 申請日： | 2018-01-15 |
| 公開（公告）號： | CN108034705A | 公開（公告）日： | 2018-05-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李澤卿 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢愛基百客生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6869 | 分類號： | C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253 | 代理人： | 馮子玲 |
| 地址： | 430000 湖北省武漢市東湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基因組 甲基化 通量 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種全基因組甲基化高通量測序方法，包括如下步驟：將基因組測序樣本，連接上CCGG位點的接頭，隨后用MmeI酶切，在用連接酶連接上基因組測序樣本上的第二個接頭，將擴增后的基因組測序樣本使用PTP平板，且測序模板表面放置有ATP硫化酶以及熒光素酶，測序開始時，A、T、C、G四種堿基依照固定順序依次循環(huán)進行入PTP平板，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸結(jié)合形成ATP，在熒光素酶的催化下，生成的ATP和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，在反應(yīng)所釋放的光信號被高靈敏度的CCD捕獲，并生成測序圖像。本發(fā)明能夠?qū)蚪M進行準(zhǔn)確的測序，能夠?qū)⒒蚪M序列顯示在我們眼前。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因測序技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種全基因組甲基化高通量測序方法。
背景技術(shù)
高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(next generationsequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序(Massively Parallel SignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸測序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測序(Ion semiconductor sequencing)、DNA納米球測序(DNA nanoball sequencing)等。隨著現(xiàn)在科技的不斷進步，現(xiàn)有的測序方法已經(jīng)滿足不了現(xiàn)在的發(fā)展速度。為此，我們提出了一種全基因組甲基化高通量測序方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種全基因組甲基化高通量測序方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
本發(fā)明提出了一種全基因組甲基化高通量測序方法，包括如下步驟：
S1：選取基因組，并利用限制性內(nèi)切酶對基因組進行酶切，以便獲得基因組片段，并將獲取的基因組片段置于零下15-零下8攝氏度的條件下進行放置，放置環(huán)境需為無菌環(huán)境；
S2：在放置36-48h后，將基因組片段取出，并置于5-8攝氏度的環(huán)境中，然后將所述基因組片段進行末端修復(fù)，以便獲得經(jīng)過末端修復(fù)的基因組片段，修復(fù)后的基因組片段再次放置在器皿內(nèi)，并向器皿內(nèi)添加亞硫酸鹽，且亞硫酸鹽需漫過基因組片段，并對基因組片段進行實時晃動，從而使其均勻接觸，待其放置4-7min后，則完成對基因組片段的修飾，從而形成基因組測序樣本；
S3：將S2中形成的基因組測序樣本，對樣本上的CCGG位點進行確定，然后連接上CCGG位點的接頭，隨后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位點的18-19bp的標(biāo)簽序列，在用連接酶連接上基因組測序樣本上的第二個接頭，然后對其進行擴增，且擴增的溫度為25-35攝氏度；
S4：將S3中擴增后的基因組測序樣本使用PTP平板，且PTP平板含有160萬個光纖孔，在測序反應(yīng)中，每個光纖孔內(nèi)都固定有測序模板，且測序模板表面放置有ATP硫化酶以及熒光素酶，測序開始時，A、T、C、G四種堿基依照固定順序依次循環(huán)進行入PTP平板，且每次只進入一個堿基，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸結(jié)合形成ATP，在熒光素酶的催化下，生成的ATP和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光；
S5：在S4中反應(yīng)所釋放的光信號被高靈敏度的CCD捕獲，并生成測序圖像，從而獲得待測模板的測序信息。
優(yōu)選的，在S2中的修飾過程中，必須保證pH值的準(zhǔn)確度。
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