[發(fā)明專利]一種全基因組甲基化高通量測序方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810035958.2
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108034705A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李澤卿
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢愛基百客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種全基因組甲基化高通量測序方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：選取基因組，并利用限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，以便獲得基因組片段，并將獲取的基因組片段置于零下15-零下8攝氏度的條件下進(jìn)行放置，放置環(huán)境需為無菌環(huán)境；

S2：在放置36-48h后，將基因組片段取出，并置于5-8攝氏度的環(huán)境中，然后將所述基因組片段進(jìn)行末端修復(fù)，以便獲得經(jīng)過末端修復(fù)的基因組片段，修復(fù)后的基因組片段再次放置在器皿內(nèi)，并向器皿內(nèi)添加亞硫酸鹽，且亞硫酸鹽需漫過基因組片段，并對基因組片段進(jìn)行實(shí)時(shí)晃動(dòng)，從而使其均勻接觸，待其放置4-7min后，則完成對基因組片段的修飾，從而形成基因組測序樣本；

S3：將S2中形成的基因組測序樣本，對樣本上的CCGG位點(diǎn)進(jìn)行確定，然后連接上CCGG位點(diǎn)的接頭，隨后用MmeI酶切，可得到一段包含HpaII酶切位點(diǎn)的18-19bp的標(biāo)簽序列，在用連接酶連接上基因組測序樣本上的第二個(gè)接頭，然后對其進(jìn)行擴(kuò)增，且擴(kuò)增的溫度為25-35攝氏度；

S4：將S3中擴(kuò)增后的基因組測序樣本使用PTP平板，且PTP平板含有160萬個(gè)光纖孔，在測序反應(yīng)中，每個(gè)光纖孔內(nèi)都固定有測序模板，且測序模板表面放置有ATP硫化酶以及熒光素酶，測序開始時(shí)，A、T、C、G四種堿基依照固定順序依次循環(huán)進(jìn)行入PTP平板，且每次只進(jìn)入一個(gè)堿基，在ATP硫化酶的作用下，生成的PPi和磷酰硫酸結(jié)合形成ATP，在熒光素酶的催化下，生成的ATP和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光；

S5：在S4中反應(yīng)所釋放的光信號被高靈敏度的CCD捕獲，并生成測序圖像，從而獲得待測模板的測序信息。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全基因組甲基化高通量測序方法，其特征在于：在S2中的修飾過程中，必須保證pH值的準(zhǔn)確度。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全基因組甲基化高通量測序方法，其特征在于：在S3中的擴(kuò)增具體步驟如下：將基因組測序樣本利用微乳液PCR在固定有擴(kuò)增引物的微球表面上延伸待測模板，擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)液滴就相當(dāng)于一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)器，并包括一個(gè)微球、一條模板以及擴(kuò)增酶，擴(kuò)增完成時(shí)，成功擴(kuò)增的微球表面存在2*107-5*107個(gè)克隆。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全基因組甲基化高通量測序方法，其特征在于：在S5中待測模板需完全被聚合為雙鏈。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全基因組甲基化高通量測序方法，其特征在于：在S2中對基因組片段進(jìn)行末端修復(fù)前，需要預(yù)先對基因組片段進(jìn)行純化，以保證基因組片段的干凈度。