[發明專利]一種無內毒素質粒大量制備工藝

在審

• 申請號: 201810034434.1
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108148831A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 楊永坤;孟廣榮
• 申請（專利權）人: 南京馴鹿醫療技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 伍兵

1.一種無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是，包括步驟：

(1)菌種發酵；

(2)菌體細胞的收集；

(3)菌體的裂解；

(4)菌體裂解產物固液分離，收集液體部分；

(5)菌體裂解產物液體部分的純化；

所述步驟(5)包括添加內毒素去除緩沖液，低溫處理和電離層析去除雜質和其他質粒，收集目標質粒。

2.根據權利要求1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是，所述內毒素去除緩沖液pH7.0，包含3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS),氯化鈉(NaCl)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton100)，所述Triton X100濃度為5～15％,MOPS含量為30～80mM,所述NaCl濃度為500～100Mm。

3.根據權利要求1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是，所述菌體裂解產物液體部分的純化采用自動分離層析系統。

4.根據權利要求1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是，所述自動分離層析系統是陰離子交換層析柱，所述陰離子交換層析的柱平衡緩沖液、洗雜緩沖液和洗脫緩沖液的pH都為7.0,并含選自3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS),氯化鈉(NaCl)和異丙醇，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton 100)的三到四種，所述柱平衡緩沖液中MOPS含量為30～80mM,所述NaCl濃度為500～1000Mm；異丙醇為10％～20％，Triton 100濃度為0.8～0.22％，所述洗雜緩沖液中MOPS含量為30～80mM,所述NaCl濃度為750～1500Mm；異丙醇含量為10～15％；所述洗脫緩沖液包含NaCl,異丙醇和Triton 100，所述洗脫緩沖液中NaCl的濃度為為1500～2000mM,所述異丙醇的濃度為為10～15％，所述Triton 100的濃度為10～20％。

5.根據權利要1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是步驟(1)所述發酵包括搖瓶發酵和發酵罐發酵；或所述發酵可選的培養基包括LB、SB、TSB、TB四種培養基，或優選TB培養基和SB培養基，或更優選TB培養基。

6.根據權利要1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是步驟(2)所述的菌體收集包括離心和膜過濾。

7.根據權利要1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是步驟(4)所述的裂解產物的固液分離方法包括離心法和膜過濾法。

8.根據權利要1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是，步驟(5)所述的低溫處理選自冰浴或4℃30分鐘。

9.根據權利要1所述的無內毒素質粒的大量制備方法，其特征是，步驟(5)所述包括收集超螺旋質粒洗脫峰。

10.權利要求1所述的方法在基因治療和疫苗生產領域中的應用。