[發明專利]一種無內毒素質粒大量制備工藝

在審

• 申請號: 201810034434.1
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108148831A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 楊永坤;孟廣榮
• 申請（專利權）人: 南京馴鹿醫療技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 伍兵

本發明屬于生物技術領域，具體公開了一種無內毒素質粒的大量提取技術，其特征是包括步驟菌種發酵、菌體細胞的收集、菌體的裂解、菌體裂解產物固液分離，收集液體部分和菌體裂解產物液體部分的純化；純化包括添加內毒素去除緩沖液，低溫處理和電離層析去除雜質和其他質粒，收集目標質粒；所述內毒素去除緩沖液pH7.0，包含3?(N?嗎啡啉)丙磺酸,氯化鈉、聚乙二醇辛基苯基醚。該方法不使用動物源性的RNase A和蛋白酶K,以及對人體和動物有毒副作用的苯酚、氯仿；各項指標能達到或接近相關領域如美國食品和藥品管理局(FDA)的質量標準；同時可以線性放大。為真核生物產品的工廠化生產和基因治療產業的發展提供了重要的技術手段。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及質粒提取技術，具體涉及一種無內毒素質粒的大量提取技術。

背景技術

質粒是一類小的、雙鏈環裝DNA分子，攜帶染色體以外的遺傳信息。由于質粒具有自我復制功能，一個細胞可含有多個拷貝的質粒。過去的數十年中，質粒已經成為遺傳學、分子生物學等領域最重要的工具，尤其是近些年來，更成為基因治療和基因疫苗等醫藥領域必不可少的工具。當前質粒DNA在基因治療和基因疫苗等臨床研究中的應用越來越重要。隨之而來的是，治療領域對質粒的生產技術的要求要求越來越高。既要求具有高產量，也要求高純度和雜質含量低至復合臨床治療用途的標準?，F有技術中，商品化的質粒純化試劑盒不適用于制備足量的克級及以上的質粒產品。更重要的是，最終質粒產物的數量和純度都不是完全能夠重復的，這也是規?；a的先決條件，尤其是在藥物領域的應用。同時，根據世界衛生組織(WHO)標準，質粒DNA的純化過程不能使用動物源的酶(RNase A和蛋白酶K)；不能使用對人畜有毒的苯酚、氯仿等有機溶劑；避免大量使用易燃、易爆的無水乙醇和異丙醇等有機溶劑。所純化的質粒DNA純度要求高，參照人醫的評價標準，其A260/A280在1.75-1.85之間,用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測不到RNA；二辛可寧酸檢測蛋白的含量在0.001ug/ug質粒DNA；宿主基因組的含量應小于10ng/ug質粒DNA；超螺旋質粒純度應大于90％?，F有技術生物技術基因治療行業尚需開發一種產量高，無內毒素的質粒大量提取方法

發明內容

本發明的目的是提供一種無內毒素質粒大量制備工藝，滿足基因治療和疫苗生產領域的需要

本發明實現上述目的技術方案如下:

第一方面，本發明提供了一種無內毒素質粒的大量制備方法，其包括步驟：

(1)菌種發酵；

(2)菌體細胞的收集；

(3)菌體的裂解；

(4)菌體裂解產物固液分離，收集液體部分；

(5)菌體裂解產物液體部分的純化；

所述步驟(5)包括添加去除內毒素的緩沖液，低溫處理和電離層析去除雜質和其他質粒，收集目標質粒；

所述內毒素去除緩沖液包含pH7.0,Triton X100,MOPS,NaCl，所述 Triton X100濃度為5～15％,所述MOPS含量為30～80mM,所述NaCl 濃度為500～100Mm。