[發明專利]重組牛抵抗素蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201810033929.2
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108315341A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 左之才;陽明賢;岑垚;馬志宇;姚彩霞;沈留紅;鄧俊良;馬曉平;余樹民;茍麗萍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/575
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種重組牛抵抗素蛋白及其制備方法。針對現有制備牛抵抗素蛋白的方法表達的蛋白所含標簽過大，容易造成蛋白構象的改變，不利于活性研究等問題，本發明提供了一種重組牛抵抗素蛋白的制備方法，包括以下步驟：RT?PCR方法擴增出牛抵抗素基因，構建pET21a?RETN載體，轉化至大腸桿菌，經選擇性培養、PCR檢測、雙酶切鑒定、基因測序，選擇帶有目的性基因的質粒；再將pET21a?RETN載體轉化至大腸桿菌BL21、Rosetta，誘導表達牛抵抗素蛋白。本發明方法操作簡單，成本低廉，表達量高，能夠高效制備大量重組牛抵抗素蛋白，為一步對其生理功能的研究和應用于相關疾病的預防和治療奠定基礎。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種重組牛抵抗素蛋白及其制備方法。

背景技術

抵抗素(Resistin,RETN)是在研究胰島素增敏劑-噻唑烷二酮衍生物(thaiazolidiones)的作用機制時，于小鼠脂肪組織發現的一種特異性小分子蛋白質。目前研究發現其不僅參與脂糖代謝，調解機體能量水平；甚至還參與炎癥反應，是炎癥發生過程的重要調控因子，但由于缺少抵抗素原材料，阻礙進一步對其生理功能的研究和應用于相關疾病的預防和治療。

現有技術中很少有用克隆表達的方法制備牛抵抗素的研究，并且在以往的研究中，沒有對克隆條件進行篩選，不利于大量表達，且表達蛋白標簽過大，對蛋白原有構象的影響較大，不利于蛋白活性的研究。

發明內容

本發明要解決的技術問題為：現有制備牛抵抗素蛋白的方法表達的蛋白所含標簽過大，容易造成蛋白構象的改變，不利于活性研究等問題。

本發明解決上述技術問題的技術方案為：提供一種重組牛抵抗素蛋白及其制備方法。該方法產量大、操作簡單，價格低廉，適宜推廣使用。

本發明提供一種重組牛抵抗素蛋白的制備方法，包括以下步驟：

a、根據牛抵抗素基因序列設計擴增引物；

b、提取牛的總RNA，RT-PCR得到牛抵抗素基因；

c、構建pET21a-RETN原核表達載體，轉化至大腸桿菌DH5a，經選擇性培養、PCR檢測、雙酶切鑒定、基因測序，選擇帶有牛抵抗素基因的菌液抽提質粒；

d、將步驟c選擇的質粒轉化至大腸桿菌BL21或Rosetta中，經選擇性培養、PCR檢測、雙酶切鑒定、基因測序，選擇帶有牛抵抗素目的條帶的菌液，轉接培養獲得菌液，進行SDS-PAGE、免疫印跡試驗，再經鎳柱過濾，純化，得到可溶性的重組牛抵抗素蛋白。

其中，上述重組牛抵抗素蛋白的制備方法中，步驟a所述的引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：1P1:5’GCTCTAGAATGAAGGCTCTCTCCTTC，5’端帶GC保護性堿基和XbaI酶切位點；

SEQ ID NO：2P2:5’CTCGAGCTGGATATGCAGGCG，5’帶XhoI酶切位點。

其中，上述重組牛抵抗素蛋白的制備方法中，步驟d所述轉接培養時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，適宜的加入濃度為0.2-1.0mmol/L。優選為1.0mmol/L。

其中，上述重組牛抵抗素蛋白的制備方法中，步驟d所述轉接培養時誘導溫度為20-35℃。優選20℃。

其中，上述重組牛抵抗素蛋白的制備方法中，步驟d所述轉接培養時誘導時間為10-16h。優選為14h。

其中，上述重組牛抵抗素蛋白的制備方法中，所述的轉化培養基和選擇培養基均為LB+1％Ampicillin。

本發明還提供了一種重組牛抵抗素蛋白，由上述方法制備而成。