[發明專利]重組牛抵抗素蛋白及其制備方法在審
| 申請號： | 201810033929.2 | 申請日： | 2018-01-15 |
| 公開（公告）號： | CN108315341A | 公開（公告）日： | 2018-07-24 |
| 發明（設計）人： | 左之才;陽明賢;岑垚;馬志宇;姚彩霞;沈留紅;鄧俊良;馬曉平;余樹民;茍麗萍 | 申請（專利權）人： | 四川農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C07K14/575 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 611130 四*** | 國省代碼： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 素蛋白 抵抗 制備 大腸桿菌 生物工程領域 選擇性培養 研究和應用 蛋白構象 高效制備 活性研究 基因測序 生理功能 誘導表達 載體轉化 表達量 雙酶切 素基因 構建 擴增 質粒 蛋白 標簽 基因 疾病 治療 預防 轉化 | ||
1.重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
a、根據牛抵抗素基因序列設計擴增引物；
b、提取牛的總RNA，RT-PCR得到牛抵抗素基因；
c、構建pET21a-RETN原核表達載體，轉化至大腸桿菌DH5a，經選擇性培養、PCR檢測、雙酶切鑒定、基因測序，選擇帶有牛抵抗素基因的菌液抽提質粒；
d、將步驟c選擇的質粒轉化至大腸桿菌BL21或Rosetta中，經選擇性培養、PCR檢測、雙酶切鑒定、基因測序，選擇帶有牛抵抗素目的條帶的菌液，轉接培養獲得菌液，進行SDS-PAGE、免疫印跡試驗，再經鎳柱過濾，純化，得到可溶性的重組牛抵抗素蛋白。
2.根據權利要求1所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：步驟a所述的引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
3.根據權利要求1所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：步驟d所述轉接培養時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
4.根據權利要求3所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：所述的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的加入量為0.2-1.0mmol/L。
5.根據權利要求3所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：所述的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的加入量為1.0mmol/L。
6.根據權利要求1所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：步驟d所述轉接培養時誘導溫度為20-35℃。
7.根據權利要求1所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：步驟d所述轉接培養時誘導溫度為20℃。
8.根據權利要求1所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：步驟d所述轉接培養時誘導時間為10-16h，優選為14h。
9.根據權利要求1所述的重組牛抵抗素蛋白的制備方法，其特征在于：所述的轉化培養基和選擇培養基均為LB+1％Ampicillin。
10.權利要求1-9任一項所述的方法制備得到的重組牛抵抗素蛋白。
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