[發明專利]脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原同步快速鑒別、定量檢測方法及其檢測試劑盒和應用

在審

• 申請號: 201810032963.8
• 申請日: 2018-01-13
• 公開（公告）號: CN108387726A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 龍潤鄉;謝忠平;羅芳宇;楊蓉;蔡瑋;陳洪波;平玲;宋霞
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 11489
• 代理人: 蘇杭

本發明提供一種可同時對Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒（Polio virus）D抗原、單價疫苗、三價疫苗及聯合疫苗進行特異性的鑒別檢測方法，本方法酶標檢測板是將牛、兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原抗體按一定比例混合后包被在酶標檢測板中，制備成預包被板，同時配套辣根過氧化物酶標記的牛、兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒酶標抗體和其他試劑，成為可以同時對Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原快速鑒別檢測的方法，對非目標型別的脊髓灰質炎病毒C、D抗原及目標型別的C抗原無交叉，是一種特異性高、靈敏高，使用方便、節約成本、用途廣泛的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原檢測法，在IPV疫苗生產檢定中有較高的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及可以同時快速定性或定量鑒別檢測Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原的檢測方法及其檢測試劑盒和應用。

背景技術

脊髓灰質炎病毒(polio virus)屬于小核糖核酸病毒科、腸道病毒屬，分3個血清型，其主要侵犯脊髓前角灰質區運動神經元，臨床特征為弛緩性肌肉麻痹，多發生在5歲以下兒童，尤其是嬰幼兒，故亦稱小兒麻痹癥，是WHO繼天花之后要消滅的第二種傳染病的主要病原體。脊髓灰質炎病毒感染后沒有特效的治療手段，只能通過疫苗進行預防，目前用于預防控制脊灰流行的疫苗有兩種：脊髓灰質炎減毒活疫苗(OPV)和滅活脊髓灰質炎疫苗(IPV) ，OPV因易于接種，成本相對較低而一度被廣泛使用，但在長期使用過程中發現，其可能引起脊灰疫苗相關麻痹(VAPP)病例和疫苗衍生株脊灰病毒VDPV) ，IPV則能有效避免VAPP和VDPV的發生。因此，徹底消滅脊灰病毒最終需要用IPV全部取代OPV進行預防控制。

脊髓灰質炎病毒共有3個血清型，分別為PolioⅠ、Ⅱ、Ⅲ型、Polio Ⅱ型和Polio Ⅲ型，3個型別的病毒顆粒均有2種形式，分別為具有感染性的完整病毒顆粒形式的D抗原和不具有感染性的空心顆粒C抗原。C抗原通過D抗原感染細胞過程、加熱、紫外線照射、堿變性、毒力降解而產生，其VP4消失而無感染性。 D抗原具有免疫原性，可誘導機體產生保護性中和抗體，從而預防脊髓灰質炎的發生，而C抗原雖有組特異性，但免疫血清尚不能中和病毒，由于D抗原含量與滅活脊髓灰質炎疫苗（IPV)接種后機體產生免疫效力之間具有較好的一致性，因此，D抗原作為IPV疫苗的主要成分抗原，其含量是IPV疫苗體外效力的關鍵指標，對IPV疫苗生產質控具有重要意義。

D抗原檢測在IPV疫苗生產、質量控制過程中時常用到，單價原液檢測、半成品配制、三價半成品檢測、成品檢定都有涉及脊灰病毒D抗原檢測的項目，由于D抗原含量是IPV疫苗質量的一個重要標準，直接影響疫苗的保護效果，因此D抗原檢測方法的優劣和便捷在一定程度上可以直接影響到疫苗的生產進程和質量標準。

酶標檢測板目前市場上并沒有商售的脊灰病毒D抗原檢測試劑盒。現有的D抗原檢測方法（試劑）無2~3天才能完成一個檢測，周期過長，影響疫苗檢定的時效，并且對檢測人員的操作技能要求高，換操作人員即有可能導致人員操作偏差出現，不利于疫苗質量的穩定性。基于市場的需求和疫苗生產檢定的要求，申請人研發了一種Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IPV病毒D抗原定性或定量快速聯合檢測的方法，可以進行預包被，批量生產，全部檢測時間從3天縮短為3.5小時，有效提高了疫苗的檢定工作效率和檢測結果的穩定性。

發明內容

基于上述現有技術存在的缺陷和不足，本發明旨在提供一種脊髓灰質炎病毒（Polio virus）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原聯合檢測方法，該方法可以同時對脊髓灰質炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原進行高特異性的精準定性和定量檢測。本發明還提供了一種預包被的可以進行批量生產的脊髓灰質炎病毒（Polio virus）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原檢同步檢測試劑盒。

一方面，本發明提供了一種脊髓灰質炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原同時快速鑒別檢測、定量檢測方法，用于非臨床疾病診斷治療和非健康狀況判斷用途，包括以下步驟：