[發明專利]脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原同步快速鑒別、定量檢測方法及其檢測試劑盒和應用

在審

• 申請號: 201810032963.8
• 申請日: 2018-01-13
• 公開（公告）號: CN108387726A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 龍潤鄉;謝忠平;羅芳宇;楊蓉;蔡瑋;陳洪波;平玲;宋霞
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 11489
• 代理人: 蘇杭

1.脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原同步快速鑒別、定量檢測方法，用于非臨床疾病診斷治療和非健康狀況判斷用途，其特征在于，包括以下步驟：

S1、分別對動物抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒單價抗體進行制備并純化，得動物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原的單價純化抗體；

S2、用辣根過氧化物酶通過高碘酸鈉法分別對對動物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原的單價純化抗體進行標記，得動物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原的檢測用單價酶標抗體，制成單價酶標抗體使用液；

S3、將動物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原單價純化抗體按等量比例混合后包被或預包被酶標檢測板，預包被處理中加入保護劑進行封閉保護；所述保護劑包括但不限于以下成分：BSA、明膠，酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸鹽、碳酸鹽中的一種或多種，包被板經真空包裝處理后制得預包被載體，所得預包被載體能批量制作且能滿足檢測條件指標下實現長期存放；

S4、加入待檢樣品：脊髓灰質炎病毒的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型單價或二價或三價樣品，單價樣品加1孔，二價樣品加2孔、三 價樣品加3孔形成抗原抗體復合物，通過洗板去除未結合的非目標樣品，分別加入相應型別的單價的酶標記抗體使用液，待檢抗原與對應的單價酶標記抗體結合，通過底物催化酶顯色，根據顯色結果完成對脊髓灰質炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原同時快速鑒別檢測或定量檢測。

2.根據權利要求1所述的脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原同步快速鑒別、定量檢測方法，其特征在于，步驟S3中所述保護劑為：每1000ml保護劑包含7~13g BSA，7~13海藻糖、3~7g明膠，1~2g酪蛋白，30~70mMol磷酸鹽溶液；所述預包被載體使用抽真空包裝后存放。

3.根據權利要求2所述的脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原同步快速鑒別、定量檢測方法，其特征在于，純化抗體的制備步驟包括：

1）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原抗血清制備：將滅活脊髓灰質炎病毒分別通過10-30%蔗糖密度梯度離心，收集D抗原層，經電鏡檢測確認為所需型別的D抗原后，用于免疫血清制備；試驗動物牛或兔或羊，首免，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型單價滅活病毒D抗原10-20ml與福氏佐劑等量混勻，皮下注射免疫，每個型免疫1-2只動物，避免交叉，進行3次加強免疫后采血，分離血清，采用微量中和試驗進行血清中和抗體滴度測定；

2）牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原單價純化抗體制備：取蛋白A/G親和層析柱，室溫放置平衡30分鐘，用5倍柱體積的平衡液對層析柱進行平衡；將抗血清與平衡液等體積比混合后上樣，用10倍柱體積的平衡液洗脫雜蛋白，保留目的蛋白；用10倍柱體積的常規洗脫液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來，收集洗脫峰，脫鹽后備用；用lowrrry法測定蛋白含量，得各型牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原純化抗體，-20℃以下保存待用，各個型的免疫血清分開進行純化，不可交叉，純化產物不可混淆。

4.根據權利要求1所述的脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原同步快速鑒別、定量檢測方法，其特征在于，所述S2步驟包括：將辣根過氧化物酶用注射用水溶解后，加入NaIO4，靜置，加入乙二醇溶液，靜置，再與步驟S1所得純化抗體混合，透析過夜；加硼氫化鈉，靜置，加飽和硫酸銨，離心；取沉淀溶解后透析過夜；得到牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原檢測用單價酶標抗體，低溫保存備用，標記過程各型抗體分開進行，不可交叉混淆。

5.根據權利要求1所述的脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原同步快速鑒別、定量檢測方法，其特征在于，所述S3步驟包括：

1）酶標檢測板包被：將純化好的牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒D抗原的單價純化抗體分別通過棋盤試驗確認包被條件，1：1：1比例稀釋混勻抗體后加至酶標檢測板中，50-150μl/孔2～8℃過夜，洗板； 2）酶標檢測板封閉：以100-250μl/孔的量加入保護劑封閉，2～8℃過夜，洗板，晾干，真空包裝后冰箱保存備用。