[發明專利]用陽離子脂質體包裹負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒的制備方法

在審

• 申請號: 201810032266.2
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108562737A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 常津;潘惠卓;王漢杰;諶紅彬;王天歌;張超楠;王鎬鋒;郝亞鋒
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G01N33/532
• 分類號: G01N33/532
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

本發明涉及用陽離子脂質體包裹負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒的制備方法。將鈣黃綠素負載到介孔二氧化硅中；制備粒徑均一的陽離子脂質體將陽離子脂質體包裹到負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒外。本發明制備的陽離子脂質體包裹負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒，制備出的陽離子脂質體包裹負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒的粒徑在80～130納米之間，加入細胞后細胞存活率為80％～90％，用倒置熒光顯微鏡觀察活細胞標記的效率約占90％～95％，通過觀察納米顆粒內鈣黃綠素的分布情況來判斷活細胞的位置，可實現高效的活細胞標記。

技術領域

本發明涉及一種可標記及定位活細胞的納米顆粒的制備方法，屬生物技術和醫藥技術領域。特別涉及用陽離子脂質體包裹負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒的制備方法。

背景技術

鈣黃綠素通常被用在絡合指示劑熒光指示劑等領域，由于其本身具有親水性，使其不容易穿透細胞膜，加入細胞后停留在細胞間隙，因此無法用于活細胞標記。目前用鈣黃綠素標記活細胞的方法是在鈣黃綠素表面加強疏水修飾形成活細胞染料Calcein(鈣黃綠素)-AM，其在疏水作用穿透活細胞膜后，活細胞內的酯酶會將其水解，使鈣黃綠素停留在細胞內，發出強綠色熒光，從而實現活細胞標記。但這種染料價格昂貴，用于細胞實驗需較多劑量；合成方法較繁瑣，不適用于實驗室常規制備。因此，需要改造一種制備簡單、價格低廉且工作效率高的鈣黃綠素活細胞標記方法，用于更廣泛的研究。納米顆粒通常被用于負載染料、藥物等各種小分子物質，其中作用最廣泛的是介孔二氧化硅納米顆粒。但由于二氧化硅其本身具有一定毒性，加入細胞后會對細胞造成一定損傷。細胞吸收二氧化硅納米顆粒通常要經過胞飲過程，但這種方法耗時長、效率低，在這個過程中，被二氧化硅納米顆粒負載的藥物存在泄漏等損耗，具有潛在毒性的同時也降低了藥物功效。因此，研制出一種將鈣黃綠素負載至介孔二氧化硅納米顆粒，同時用陽離子脂質體包封顆粒表面的方法，能夠增加細胞對顆粒的內吞效率，減少二氧化硅顆粒對細胞的毒性，實現對活細胞的標記。

發明內容

根據現有技術的不足，我們提出了具有活細胞標記率高、細胞毒性小等優勢的可標記活細胞的新型納米顆粒的制備方法。

本發明的技術方案如下：

用陽離子脂質體包裹負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒的制備方法；包括如下步驟：

(1)將鈣黃綠素負載到介孔二氧化硅中；

(2)制備粒徑均一的陽離子脂質體；

(3)將陽離子脂質體包裹到負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒外。

所述步驟(1)制備方法是：將鈣黃綠素與介孔二氧化硅納米顆粒溶液混合均勻，避光磁力攪拌6～12小時，離心收集，沉淀用雙蒸水重懸，得到負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒。

優選用去離子水將鈣黃綠素配置成濃度250～300微摩爾的溶液，加入質量比1:10～5介孔二氧化硅納米顆粒，混合均勻。

優選避光磁力攪拌速度是300～400轉/分鐘，10000～15000轉/分鐘離心10～15分鐘，離心收集，沉淀用雙蒸水重懸定量至1～5毫克每毫升，得到負載鈣黃綠素的介孔二氧化硅納米顆粒。

所述步驟(2)制備方法是：稱取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺并加入三氯甲烷溶解；去除溶劑后，向反應器中加入質量分數50％的磷酸鹽緩沖液，超聲30～40分鐘，得到云霧狀白色液體，為懸浮在磷酸鹽緩沖液中的粒徑不等的陽離子脂質體；將以上溶液用孔徑100納米的濾膜過濾，得到的澄清穩定液體即為粒徑均一的陽離子脂質體。

優選稱取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺加入三氯甲烷配制成濃度為2～10毫克每毫升的溶液溶解；將旋轉蒸發儀的水浴鍋溫度設置至36～42℃，打開真空泵抽真空30～40分鐘后，在反應器形成一層乳白色覆蓋物，再加入質量分數50％的磷酸鹽緩沖液體。