[發明專利]一種綠色熒光蛋白的融合表達方法在審

申請號：	201810031486.3	申請日：	2018-01-12
公開（公告）號：	CN108220313A	公開（公告）日：	2018-06-29
發明（設計）人：	郝曉亮;高云;全艷玲;王勇;費愛萍;方志剛;姜俊羽;馬詩文	申請（專利權）人：	遼寧科技大學
主分類號：	C12N15/63	分類號：	C12N15/63;C12N15/66;C07K14/435
代理公司：	鞍山嘉訊科技專利事務所 21224	代理人：	張群
地址：	114044 遼***	國省代碼：	遼寧;21
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摘要：
搜索關鍵詞：	測序綠色熒光蛋白融合表達載體片段試劑盒操作電泳實驗成本試劑消耗梯度離心粘性末端醋酸鈉重現性除掉酶切洗脫成功率
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【說明書】：

本發明涉及一種綠色熒光蛋白的融合表達方法，包括酶切、連接、轉質及測序，其中,通過使用PCI、CIA、醋酸鈉進行洗脫，通過梯度離心除掉反應體系中的雜質。將目的DNA片段和載體片段分別進行CIAP處理，使目的DNA片段和載體片段的末端成為粘性末端，提高連接成功率。減少了測序操作由于雜質存在而影響測序的準確性。得到的DNA純度較高。步驟操作簡單，重現性好，試劑消耗少，降低實驗成本，其電泳效果與試劑盒操作相當。

技術領域

本發明涉及基因工程中的DNA重組及操作，具體涉及一種綠色熒光蛋白的融合表達方法。

背景技術

基因工程(genetic engineering)又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。基因工程技術為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段。

專利201710232127公開了一種綠色熒光蛋白偶聯的瓊脂糖的制備方法，以PCR的方式獲得基因產物；201610942279.4公開了一種改良的綠色熒光蛋白表達載體及其構建方法，通過設計引物，選擇酶切位點，PCR及酶切后獲得新的表達載體；專利200910077103.7公開了融合表達綠色熒光蛋白的表達載體及其構建方法與應用，通過PCR擴展和設計引物來構建表達載體；專利201611044468公開了一種攜帶增強型綠色熒光蛋白標記的轉基因家兔及其構建方法，涉及將啟動子優化的重組基因的導入；專利200910077103.7公開了一種融合表達綠色熒光蛋白的表達載體及其構建方法與應用。以上相關的各個專利對于綠色熒光蛋白的酶切、連接、轉質及測序等方面沒有詳細的論述。

DNA的限制性酶切、精制、連接及轉質等操作已經廣泛應用于科學研究中，但是不同研究機構學者使用的方法也不盡相同。目前很多生化試劑廠家有專門的試劑盒進行銷售，但是購買試劑盒價格較為昂貴。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種綠色熒光蛋白的融合表達方法，該操作方法成熟可靠，得到的DNA純度較高，并且DNA連接成功率較高，實驗重復性好。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案實現：

一種綠色熒光蛋白的融合表達方法，包括酶切、連接、轉質及測序，其中具體包括以下步驟：

1.綠色熒光蛋白酶切方法

1)綠色熒光蛋白EcoRI酶酶切

將綠色熒光蛋白、滅菌水、緩沖液及EcoRI酶加入到離心管中，在水浴下加熱，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸鈉分別進行離心濃縮，去除溶液中多余的脂類、糖類雜質，得到具有EcoRI酶酶切位點的綠色熒光蛋白DNA，保存到TE溶液中；

2)綠色熒光蛋白HindIII酶酶切

將上步獲得的具有EcoRI酶酶切位點的綠色熒光蛋白DNA溶液，滅菌水、緩沖液、HindIII酶進行水浴下加熱，再分別加入溶液PCI、CIA、醋酸鈉分別離心濃縮，去除溶液中多余的脂類、糖類雜質，得到具有EcoRI酶和HindIII酶兩個酶切位點的目的DNA片段，保存到TE溶液中；

2.表達載體酶切方法

1)表達載體EcoRI酶酶切