[發明專利]一種綠色熒光蛋白的融合表達方法在審
| 申請號： | 201810031486.3 | 申請日： | 2018-01-12 |
| 公開（公告）號： | CN108220313A | 公開（公告）日： | 2018-06-29 |
| 發明（設計）人： | 郝曉亮;高云;全艷玲;王勇;費愛萍;方志剛;姜俊羽;馬詩文 | 申請（專利權）人： | 遼寧科技大學 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/66;C07K14/435 |
| 代理公司： | 鞍山嘉訊科技專利事務所 21224 | 代理人： | 張群 |
| 地址： | 114044 遼*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 測序 綠色熒光蛋白 融合表達 載體片段 試劑盒操作 電泳 實驗成本 試劑消耗 梯度離心 粘性末端 醋酸鈉 重現性 除掉 酶切 洗脫 成功率 | ||
1.一種綠色熒光蛋白的融合表達方法，包括酶切、連接、轉質及測序，其特征在于，其中具體包括以下步驟：
(1)綠色熒光蛋白酶切方法
1)綠色熒光蛋白EcoRI酶酶切
將綠色熒光蛋白、滅菌水、緩沖液及EcoRI酶加入到離心管中，在水浴下加熱，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸鈉分別進行離心濃縮，去除溶液中多余的脂類、糖類雜質，得到具有EcoRI酶酶切位點的綠色熒光蛋白DNA，保存到TE溶液中；
2)綠色熒光蛋白HindIII酶酶切
將上步獲得的具有EcoRI酶酶切位點的綠色熒光蛋白DNA溶液，滅菌水、緩沖液、HindIII酶進行水浴下加熱，再分別加入溶液PCI、CIA、醋酸鈉分別離心濃縮，去除溶液中多余的脂類、糖類雜質，得到具有EcoRI酶和HindIII酶兩個酶切位點的目的DNA片段，保存到TE溶液中；
(2)表達載體酶切方法
1)表達載體EcoRI酶酶切
將表達載體、滅菌水、緩沖液及EcoRI酶加入到離心管中，在水浴下加熱35-40℃，加熱時間1-1.5h，通過電泳確認酶切結果，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸鈉分別進行離心濃縮，去除溶液中多余的脂類、糖類雜質，得到具有EcoRI酶酶切位點的表達載體，并保存在TE溶液中；
2)表達載體HindIII酶酶切
將上步得到具有EcoRI酶酶切位點的表達載體與滅菌水、緩沖液、HindIII酶進行水浴下加熱，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸鈉分別離心，得到具有EcoRI酶和HindIII酶兩個酶切位點的載體片段，保存在TE溶液中；
(3)CIAP處理
將目的DNA片段和載體片段分別進行CIAP處理，使目的DNA片段和載體片段的末端成為粘性末端；
(4)目的DNA片段酶切后的精制
CIAP處理處理后的目的DNA片段溶液用固相萃取小柱萃取，用洗脫溶液對目的DNA片段溶液進行洗脫，通過離心將目的DNA片段截留下來，保存在無核水中。
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