[發(fā)明專利]一種用于人類血清十種糖鏈聯(lián)合檢測的凝集素芯片及其制備和使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810031322.0
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108333354B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜衛(wèi)東;高毅
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 盧敏

本發(fā)明公開了一種用于人類血清十種糖鏈聯(lián)合檢測的凝集素芯片及其制備和使用方法，其是在固相載體表面點陣固定有十種特異性凝集素探針，通過包被十種特異性凝集素以實現(xiàn)人血清中十種糖鏈的聯(lián)合檢測；其中，固相載體為16?氨基?1?十六烷硫醇和DOTA?NHS?ester化學(xué)修飾的金箔芯片，且DOTA?NHS?ester末端的三個羧基用EDC和NHS活化，以固定特異性凝集素為探針。本發(fā)明的芯片具有高通量、高選擇性、特異性高等優(yōu)點，更適應(yīng)于人類腫瘤糖基譜特點的研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測人類血清糖鏈水平的凝集素芯片，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

根據(jù)《2017年中國腫瘤登記年報》，中國每天有一萬人確診為癌癥，每分鐘約7人確診患癌。預(yù)期人壽命86歲時，累積患癌風(fēng)險高達(dá)36％。死亡率排前的癌癥主要為肺癌和消化系統(tǒng)癌癥。其中，胃癌的發(fā)病率和死亡率均位于中國腫瘤年報的第二位，并且胃癌已連續(xù)多年位于安徽省腫瘤發(fā)病率的第一位。雖然醫(yī)療技術(shù)、檢測手段已有了很大提高，但是由于人們對放射線、胃腸鏡等檢查的擔(dān)心和恐懼，使得腫瘤的早期檢出率一直不高。同時腫瘤的生物學(xué)行為存在明顯個體差異，大多數(shù)腫瘤缺乏特異的靶向治療藥物，并且沒有有效地用于評估療效的指標(biāo)，這些都使得患者對腫瘤的治療效果不滿意，治療手段發(fā)展緩慢。

生命代謝過程中，蛋白質(zhì)糖鏈改變往往比蛋白質(zhì)本身更容易受到疾病過程影響。已有報道，細(xì)胞膜糖蛋白和糖脂異常、糖基變化是腫瘤細(xì)胞顯著特征之一，并與腫瘤細(xì)胞黏附、侵蝕、轉(zhuǎn)移及腫瘤免疫學(xué)密切相關(guān)。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療理念發(fā)展，腫瘤標(biāo)記物篩查與應(yīng)用已成為腫瘤生物學(xué)治療重要靶標(biāo)。目前已有十種糖蛋白被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床，如HER-2、CEA、CA199、AFP和PSA等，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤預(yù)防、診斷、治療及預(yù)后判斷。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物共有十種糖鏈，其中人類有九種：D-glucose(D-Glc，D-葡萄糖)、D-mannose(D-Man，D-甘露糖)、D-galactose(D-Gal，D-半乳糖)、N-acetylglucosamine(N-GlcNAc，N-乙酰氨基葡萄糖)、N-acetylgalactosamine(N-GalNAc，N-乙酰半乳糖胺)、D-glucuronic acid(D-GlcA，D-葡萄糖醛酸)、L-fucose(L-Fuc，L-巖藻糖)、N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac，N-乙酰神經(jīng)氨酸)和D-xylose(D-Xyl，D-木糖)等。一些非正常修飾如巖藻糖基化、唾液酸化作用、β1,6分支N-glycans以及Tn antigen(被刪減的O-glycan)與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。

目前已發(fā)現(xiàn)300余種凝集素，分別來源于細(xì)菌、病毒、植物及動物。凝集素對糖鏈親和力具有個體特異性，每一種凝集素都具有針對某一種特異性糖基的專一性結(jié)合能力。因此，凝集素可作為一種探針來研究細(xì)胞膜上特定糖基。傳統(tǒng)檢測手段對于高通量蛋白質(zhì)糖基化研究評價眾說紛紜?；诖?，凝集素芯片可作為多重分析病理學(xué)樣本高通量檢測平臺。與以往傳統(tǒng)方法相比，凝集素芯片具有高通量、高選擇性、特異性高等優(yōu)點，更適應(yīng)于人類腫瘤糖基譜特點的研究。

凝集素芯片目前主要應(yīng)用于胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌以及生殖醫(yī)學(xué)等方面。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清LCA、ACA以及PHA-E+L結(jié)合的糖蛋白的糖鏈含量比正常胃以及胃炎患者明顯增加，并且ACA結(jié)合的糖鏈分子可能與胃癌預(yù)后相關(guān)。肝癌患者血清糖蛋白巖藻糖含量明顯高于正常人。但上述研究標(biāo)本大多選自患者手術(shù)大體材料或體外培養(yǎng)細(xì)胞，因此無法進(jìn)行普通人群大規(guī)模樣本的高通量篩查，缺乏對腫瘤患者進(jìn)展、療效以及預(yù)后判斷的有效手段。

以往糖鏈研究多使用商業(yè)化凝集素芯片，使用玻璃或凝膠作為包被載體，凝集素探針易于洗脫、芯片幾何圖片不佳、敏感性較低，尤其是患者血清糖鏈變化與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及與患者生存期相關(guān)性研究缺乏。因此，亟需深入研究腫瘤的糖鏈特點，尋找可以用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、治療評價、復(fù)發(fā)或進(jìn)展監(jiān)控以及生存期預(yù)警的特異性糖鏈。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測人類普通人群及腫瘤患者血清糖鏈水平的組合凝集素芯片及其制備方法和使用方法。