[發明專利]一種用于人類血清十種糖鏈聯合檢測的凝集素芯片及其制備和使用方法

有效

• 申請號: 201810031322.0
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108333354B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 杜衛東;高毅
• 申請（專利權）人: 安徽醫科大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 盧敏

1.一種用于人類血清十種糖鏈聯合檢測的凝集素芯片在制備胃癌血清樣本檢測試劑盒中的用途，其特征在于：所述凝集素芯片是在固相載體表面點陣固定有十種特異性凝集素探針，通過包被十種特異性凝集素以實現人血清中十種糖鏈的聯合檢測；

所述固相載體為16-氨基-1-十六烷硫醇和DOTA-NHS-ester化學修飾的金箔芯片，且DOTA-NHS-ester末端的三個羧基用EDC和NHS活化，以固定特異性凝集素為探針；

所述十種特異性凝集素探針為ConA、PNA、VVA、MAL-I、AAL、LTL、NPL、SNA、RCA-I、和AIL，分別對應于人類血清中的糖鏈α-Man、α-Glc、Galβ3GalNAc(T抗原)、GalNAc(Tn抗原)、Galβ4GlcNAc、Fucα6GlcNAc、α-Fuc、Neu5Acα6Gal、Gal和Galβ3GalNAc(sTn抗原)。

2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述凝集素芯片的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、對金箔芯片進行表面化學修飾，獲得固相載體

以濃度為0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液為修飾液1；以濃度為10mM的DOTA-NHS-ester的DMSO溶液為修飾液2；將NHS和EDS溶于0.1M、pH＝3.5的MES緩沖液中作為修飾液3，在所述修飾液3中NHS濃度為50mM、EDC濃度為200mM；

對金箔芯片進行清洗后，浸入所述修飾液1中，黑暗條件下室溫搖蕩孵育12小時，使16-氨基-1-十六烷硫醇通過Au-S鍵組裝到金箔芯片，取出后用無水乙醇溶液清洗、氮氣吹干，完成第一層修飾；在干燥的金箔芯片上每孔點樣0.78μL修飾液2，然后置于干燥的孵育盒中室溫下孵育12小時，取出后用DMSO溶液清洗、氮氣吹干，完成第二層修飾；

在進行步驟2的固定探針前，再在金箔芯片上每孔點樣0.84μL修飾液3，然后置于密閉的濕盒中室溫下孵育0.5小時，使DOTA-NHS-ester末端的三個羧基活化，從而使其可通過酰胺反應穩定結合凝集素探針，取出后用PBST緩沖液清洗、氮氣吹干，即獲得固相載體待用；

步驟2、固定十種特異性凝集素作為探針

稱取HEPES粉末0.2383g和無水氯化鈣0.0011g溶于100mL純水中，調節pH值至8.5，獲得HEPES緩沖液；然后將十種凝集素分別溶于所述HEPES緩沖液中，并使各凝集素的終濃度為1mg/mL，獲得相應的凝集素溶液；在各凝集素溶液中加入BSA，使BSA質量濃度為0.001％，用于封閉未結合的已活化的羧基，以進一步有效避免實驗的非特異性吸附；

將各凝集素溶液點樣于步驟1獲得的固相載體上，在第1～10列的每一縱列中點樣一種凝集素溶液，并在第11列再點樣ConA溶液作為空白對照，每孔0.84μL，然后置于濕盒中室溫下孵育2小時，取出用PBST緩沖液清洗、氮氣吹干，即獲得用于人類血清十種糖鏈聯合檢測的凝集素芯片；

所述PBST緩沖液是由濃度0.01M、pH＝7.4的PBS緩沖液與Tween20混合配置而成的，在所述PBST緩沖液中Tween20的體積濃度為0.1％。

3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于：步驟1對金箔芯片進行清洗的方法為：將NH₃、H₂O₂及H₂O按體積比1：1：5混合構成TL1清洗液，將金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不銹鋼清洗盒內，82℃水浴6分鐘，取出之后用超純水沖洗，再用無水乙醇清洗、氮氣吹干。

4.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述試劑盒內包含有：權利要求1中所述的凝集素芯片；濃度0.01M、pH＝7.4的PBS緩沖液；PBST緩沖液；0.1M碳酸氫鈉緩沖液；Cy3溶液；去除血清中高豐度蛋白的層析柱；BCA蛋白濃度測定試劑盒；G-25層析柱；

所述PBST緩沖液是由濃度0.01M、pH＝7.4的PBS緩沖液與Tween20混合配置而成的，在所述PBST緩沖液中Tween20的體積濃度為0.1％；

所述0.1M碳酸氫鈉緩沖液是在100mL去離子水中加入碳酸鈉1.06g和碳酸氫鈉0.84g，然后調pH值至8.0獲得；

所述Cy3溶液是由1mg Cy3 NHS溶于50μL DMSO中獲得。