[發(fā)明專利]一種檢測結(jié)核抗體的多重液相芯片

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810030875.4
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108241052A
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆冀煥;史玲莉;楊燁;梁少軍;李云;田潔;慈穎;劉春曉;廉國勝;黃恩炯;王勝啟;沈軍;張苗;石順利;蘭景;李薇;付曉昀
• 申請（專利權(quán)）人: 河北國際旅行衛(wèi)生保健中心
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 長沙星耀專利事務(wù)所(普通合伙) 43205
• 代理人: 許伯嚴(yán)

本發(fā)明公開了一種檢測結(jié)核抗體的多重液相芯片，包括抗原藕聯(lián)編碼微球和生物素化抗體，所述抗原藕聯(lián)編碼微球?yàn)閷AM、CFP?10、EAST?6、16KD、38KD、65KD和TBGL抗原、CFP10?EAST6和38KD?16KD融合蛋白、雞IgG、Biotin?BSA、BSA、SA?PE分別偶聯(lián)在不同編碼的熒光微球上；所述生物素化抗體為用羧基活性的生物素標(biāo)記兔抗雞IgG和山羊抗人IgG。本發(fā)明建立了65KD、CFP10?EAST6和38KD?16KD多重檢測體系，結(jié)果表明，此多重體系能有效區(qū)分確診結(jié)核病人和非結(jié)核病人（P<0.05），陽性率為88.73%，明顯高于T?SPOT、TB?DOT、TB?CHECK?1和賽普克（51.2%、50.2%、39.4%和65.7%)這四種試劑盒的檢測結(jié)果。通過半年的臨床實(shí)驗(yàn)表明該體系穩(wěn)定性好、特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好，檢測時間快，初步顯示出所建立的多重檢測體系的優(yōu)勢。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種液相診斷芯片，具體為一種檢測結(jié)核抗體的多重液相芯片。

背景技術(shù)

全球經(jīng)濟(jì)化的發(fā)展、貿(mào)易的開通，交通的便捷，無不為各國旅行、探親、交易打開了方便之門，人口流動速度加快，與此同時傳染病的傳播也隨之蔓延^[2]。近年來結(jié)核病在全球范圍內(nèi)又死灰復(fù)燃,嚴(yán)重威脅著人類健康,已成為最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。傳染性肺結(jié)核，是目前《中華人民共和國國境衛(wèi)生檢疫法實(shí)施細(xì)則》中明確規(guī)定禁止入境的唯一的一種疾病。調(diào)查顯示肺結(jié)核病疫情在全球范圍內(nèi)明顯回升的一個主要原因是全球經(jīng)濟(jì)交流和移民人群的增多，因此世界衛(wèi)生組織呼吁主要移民輸出國及輸入國需要加強(qiáng)出入境或移民申請者的肺結(jié)核篩查工作^[3]。

目前臨床上常用方法為結(jié)核菌集菌涂片法、BD培養(yǎng)法、羅氏培養(yǎng)法，但是上述方法各有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)。直接涂片法適合于各類標(biāo)本，操作簡便、快速、價格低廉，適合于各級實(shí)驗(yàn)室開展，但其靈敏度低，通常每毫升含5000-10000條以上抗酸染色才能使陽性結(jié)果。培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于檢測時間需1-2個月，快速培養(yǎng)法雖然比傳統(tǒng)的落實(shí)培養(yǎng)法縮短了許多，但也需平均18天，陰性確認(rèn)仍需6周，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到結(jié)核病早期診斷的要求。近年來開展的RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)施檢測技術(shù)(SAT)雖然縮短了檢測周期，但其要求的樣本是患者的痰液，在口岸篩查過程中很難得到符合要求的檢測樣本。因此目前口岸的結(jié)核篩查工作還停留在X線進(jìn)行影像學(xué)檢查階段。

近二十年來，很多學(xué)者都致力于用免疫學(xué)的方法來檢測結(jié)核的血清抗體作為結(jié)核病篩查的輔助手段，研究證明這一方法確切可行，并大大提高了涂片、X線等方法的靈敏度，本課題組在過去的十年里也對常用的結(jié)核抗原進(jìn)行了篩查，并確定了靈敏度較高的幾種抗原，但前期的研究表明，當(dāng)不同的抗原混合在一個ELISA平板內(nèi)時，其不同抗原的含量、相互影響等因素將影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的ELISA法檢測結(jié)核病時會出現(xiàn)不同的抗原混合在一個ELISA平板內(nèi)時，其不同抗原的含量、相互影響等因素將影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性的缺陷，提供一種檢測結(jié)核抗體的多重液相芯片。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種檢測結(jié)核抗體的多重液相芯片，包括抗原藕聯(lián)編碼微球和生物素化抗體，所述抗原藕聯(lián)編碼微球?yàn)閷AM、CFP-10、EAST-6、16KD、38KD、65KD和TBGL抗原、CFP10-EAST6和38KD-16KD融合蛋白、雞IgG、Biotin-BSA、BSA、SA-PE分別偶聯(lián)在不同編碼的熒光微球上；所述生物素化抗體為用羧基活性的生物素標(biāo)記兔抗雞IgG和山羊抗人IgG。

進(jìn)一步的，所述熒光微球在偶聯(lián)前采用EDC和S-NHS進(jìn)行活化。

進(jìn)一步的，生物素化抗體的制備方法為：

(1)取出待標(biāo)記的生物素，平衡至室溫；

(2)稱取生物素1mg，溶于200μL超純水，配制成5mg/mL的1液；