[發明專利]一種腺苷酸基琥珀酸或鹽的制備方法

有效

• 申請號: 201810030628.4
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108018323B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 謝勇;王楠;趙京鳳;成鐘;趙曉宏;楊潤梅;吳崇明;郭鵬;蔡大勇;薛健
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C12N9/00;C12N15/70;C07H19/20;C07H1/06;C12R1/19
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

本發明屬治療糖脂代謝紊亂疾病候選藥物的規模化生產技術領域，為解決現有S?AMP難以生產，其價格昂貴，難以保證其成藥性研究的原料來源問題，提供一種腺苷酸基琥珀酸或鹽的制備方法，利用pET?28?a載體表達N末端帶有His?tag序列的PhAdSS，以此為催化劑催化肌苷酸IMP、L?天冬氨酸和三磷酸鳥苷GTP，進行反應合成S?AMP，反應結束后，用硅膠薄層層析分析產物中的成分，進行硅膠柱層析分離純化S?AMP。合成品內s?AMP含量為61%，回收率約20%。制備流程簡單，成本低廉，為建立工業化的S?AMP合成工藝奠定基礎。有望突破國外對S?AMP的壟斷性銷售，可大幅度降低S?AMP成藥性研究成本。

技術領域

本發明屬于治療糖脂代謝紊亂疾病候選藥物的規模化生產的技術領域，具體涉及一種腺苷酸基琥珀酸或鹽的制備方法及其應用。利用深海古細菌來源的酶來催化合成一種天然腺苷類化合物：腺苷酸基琥珀酸(鹽)，建立了實驗室小試制備方法。這種化合物具有促進胰島素分泌的功能，可作為改善糖脂代謝紊亂疾病的候選藥物開展成藥性研究。

背景技術

腺苷酸基琥珀酸(鹽)[Adenylosuccinic acid (Adenylosuccinate)，簡稱S-AMP]是一種促進胰島素分泌，使Ⅱ型糖尿病患者胰島細胞恢復正常的功能的天然腺苷類化合物[1]。前期研究中我們發現S-AMP是AMPK的一個激動劑，它的降脂活性高于降糖活性[2]。因此S-AMP可作為改善糖脂代謝紊亂新藥的候選品來開展成藥性研究。迄今為止，僅有Sigma公司銷售S-AMP (純度96%，價格約100元/mg，現停產)。目前急需研發一種降低藥物研發成本且純度增大的合成方法，降低S-AMP作為改善糖脂代謝紊亂新藥的侯選品來開展成藥性研究的成本。

生物體內的腺苷酸基琥珀酸(鹽) S-AMP合成反應是在腺苷酸基琥珀酸合成酶(AdSS)的催化下，利用肌苷酸(IMP)和L-天冬氨酸和三磷酸鳥苷(GTP)為原料合成S-AMP和二磷酸鳥苷酸(GDP)。由于IMP、L-天冬氨酸和GTP都是價格低廉的生物化工產品，發現活性高，穩定性好，因此尋找到易制備的AdSS就可開展S-AMP的大量合成。前期研究中發現古細菌Pyrococcus horikoshii OT3體內的AdSS (PhAdSS)符合這些要求[2,3]，然而什么樣的合成條件能夠高效合成S-AMP且得到純度符合成藥性研究要求的分離方法是建立生產工藝的要解決的關鍵科學問題。

發明內容

本發明為了解決現有腺苷酸基琥珀酸即S-AMP難以生產，其價格昂貴，難以保證其成藥性研究的原料來源問題，提供了一種腺苷酸基琥珀酸或鹽的制備方法，是利用酶促反應的S-AMP的小試合成及純化技術，利用PhAdSS建立了S-AMP的小試合成體系，為建立S-AMP的工業化生產工藝奠定了基礎。

本發明由如下技術方案實現的：一種腺苷酸基琥珀酸或鹽的制備方法，利用大腸桿菌表達體系pET-28-a載體表達N末端帶有MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH即His-tag序列的PhAdSS，以此重組蛋白為催化劑催化肌苷酸IMP、L-天冬氨酸和三磷酸鳥苷GTP合成S-AMP和GDP，合成反應結束后，利用硅膠薄層層析分析產物中的成分，根據硅膠薄層層析結果進行硅膠柱層析分離純化S-AMP，然后采用重結晶法進一步提高產物S-AMP的純度。

具體制備方法為：