[發(fā)明專利]一種腺苷酸基琥珀酸或鹽的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810030628.4
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108018323B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝勇;王楠;趙京鳳;成鐘;趙曉宏;楊潤梅;吳崇明;郭鵬;蔡大勇;薛健
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C12N9/00;C12N15/70;C07H19/20;C07H1/06;C12R1/19
• 代理公司: 太原晉科知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

1.一種腺苷酸基琥珀酸或鹽的制備方法，其特征在于：利用大腸桿菌表達體系pET-28-a載體表達N末端帶有MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH 即His-tag序列的古細菌Pyrococcushorikoshii OT3腺苷酸基琥珀酸合成酶（PhAdSS），以此重組蛋白為催化劑催化肌苷酸IMP、L-天冬氨酸和三磷酸鳥苷GTP合成S-AMP和GDP，合成反應(yīng)結(jié)束后，利用硅膠薄層層析分析產(chǎn)物中的成分，根據(jù)硅膠薄層層析結(jié)果進行硅膠柱層析分離純化S-AMP，然后采用重結(jié)晶法進一步提高產(chǎn)物S-AMP的純度；

具體制備方法為：

（1）催化劑的合成：a、構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-28-a-PhAdSS：在濃度分別為1μg/ml 的pET-28-a和pET-19-b-PhAdSS溶液中分別加入限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI，37℃下反應(yīng)2 小時后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行產(chǎn)物分離，100 V電壓下電泳40分鐘后，從瓊脂糖凝膠中回收pET-28-a和PhAdSS；將pET-28-a和回收的 PhAdSS的cDNA混合，加入T4DNA連接酶反應(yīng)溶液，37℃下反應(yīng)16 小時后，將反應(yīng)生成的pET-28-a-PhAdSS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌種內(nèi)，37℃恒溫箱中在含有50μg/ml 硫酸卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌12 小時活化轉(zhuǎn)化子，用含有50μg/ml 硫酸卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基37℃下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子12小時，然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET-28-a-PhAdSS；b、His-tagged-PhAdSS的表達和純化：獲得的質(zhì)粒pET-28-a-PhAdSS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌種BL21（DE3）內(nèi)，接種于自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時，PhAdSS在大腸桿菌細胞內(nèi)表達，培養(yǎng)結(jié)束后室溫下離心回收大腸桿菌細胞，然后用上樣緩沖液懸浮、離心去除沉淀，上清液用Ni-NTA蛋白質(zhì)層析柱洗脫，回收純化His-tagged-PhAdSS；

（2）S-AMP合成反應(yīng)：反應(yīng)體系體積：0.5- 5 L；反應(yīng)體系配方：20 mM GTP；10 mM IMP；11 mL L-天冬氨酸；100μg/L His-tagged-PhAdSS；MgCl₂ 4 mM，用10 M的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH為7.5；反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時間≥6小時，用硅膠薄層層析方法檢測IMP轉(zhuǎn)化率；

（3）合成反應(yīng)體系成分鑒定：合成反應(yīng)結(jié)束后，用硅膠薄層層析分析產(chǎn)物中的成分，展開劑的配方v/v：異丙醇30%，正丁醇30%，濃度為6.25%的氨水40%；

（4）S-AMP純化：a、洗脫劑配方的確定：按照硅膠薄層層析法檢測讓S-AMP和GDP在硅膠層上遷移速率最大的展開劑配方；b、樣品準備：合成反應(yīng)完成后調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值至2.9，室溫下放置至少10小時，讓過量的L-天冬氨酸析出；過濾去除固體后，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在水浴鍋上用蒸氣浴法加熱蒸發(fā)皿讓樣品體積濃縮至原來體積的10%，溶液中有不溶物生成過濾去除，或者將溶液完全蒸干，用不超過硅膠柱層析所進樣體積的去離子水充分溶解析出的固形物，不溶物過濾去除；c、硅膠層析柱的制備：用10 M NaOH水溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH至10，用分離樣品總質(zhì)量50倍的200-300目H硅膠進行層析，用無水乙醇濕法裝柱得到硅膠層析柱，硅膠柱內(nèi)硅膠填充高度低于20cm；d、上樣：用分離樣品總質(zhì)量5倍的60-100目的上樣硅膠吸附分離樣品，然后將吸附樣品的上樣硅膠加入到層析柱內(nèi)，高度低于0.5cm；e、洗脫：加入硅膠柱體積的1.5倍的流動相溶液，流動相溶液成分為v/v：乙醇60%、NH₃濃度為6.25%的氨水40%； f、回收樣品：室溫下按照每瓶50ml回收流出液，回收的流出液用硅膠薄層層析法檢測，展開極為v/v：異丙醇30%，正丁醇30%，NH₃濃度為6.25%的氨水40%；g、回收純化的S-AMP：合并S-AMP為單一成分的流出液，用10 M NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值為10，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機溶劑和氨，剩余水溶液pH值調(diào)節(jié)至3，空氣浴上蒸干，超純水溶解獲得的固體，過濾去除溶劑，空氣浴或室溫干燥；f、重結(jié)晶S-AMP：用體積比為60%的乙醇水溶液作為溶劑，在37℃恒溫箱內(nèi)配成飽和溶液，降低溫度至室溫，然后置于-20℃冰箱內(nèi)，靜置10小時以上，S-AMP重結(jié)晶，在室溫下抽濾去除液體，結(jié)晶室溫干燥即得純度為95%的成品。