[發明專利]一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的制備及應用

有效

• 申請號: 201810030128.0
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108192879B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 李偉;孫文秀
• 申請（專利權）人: 長江大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

本發明公開了一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的制備及應用，屬于水產生物技術中的功能基因突變與應用技術領域。本發明的醛酮還原酶突變蛋白為黃鱔Eakr基因的A81K位點的突變，即黃鱔Eakr基因第81號位氨基酸對應的堿基由GCT突變成了AAG，其對應氨基酸也由丙氨酸突變成賴氨酸。本發明為深入了解黃鱔醛酮還原酶Eakr的功能及其催化四聯體在底物識別上的作用提供重要的參考資料，并鑒定突變蛋白的活性及在抑制炎癥因子產生中的作用，為進一步挖掘黃鱔醛酮還原酶的功能提供技術方法。

技術領域

本發明屬于水產生物技術中的功能基因突變與應用技術領域，具體涉及一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的制備及應用。

背景技術

醛酮還原酶(aldo-keto reductase，AKR)是一類依賴NADH/NADPH作為輔酶將醛酮類物質還原為相應醇類物質的氧化還原酶。它們在生物界廣泛分布，植物、動物和微生物中均有報道。已知的醛酮還原酶數量眾多，包括16個家族近200個成員。序列比對分析發現，醛酮還原酶之間具有一定序列同源性，都具有一個典型的(α/β)₈桶狀結構。其中，醛酮還原酶負責底物催化的關鍵氨基酸一般由相對保守的催化四聯體(D-Y-K-H)組成。醛酮還原酶底物廣泛，包括醛酮類化合物、芳香類化合物、醛糖和類固醇等。

每個醛酮還原酶家族都有其特異性底物，同時在機體內行使獨特的生物學功能，例如AKR7家族可以降解致癌羰基化合物，在生物體內參與機體的保護和防御；AKR1C亞家族具有代謝人體性激素的能力，參與人體激素代謝和調節；醛糖還原酶(AR)通過將葡萄糖催化還原成山梨醇，同時減輕果糖和山梨醇在周圍組織細胞中的過多積累，從而達到抑制糖尿病的功能。國內外對魚類醛酮還原酶基因及功能的研究相對匱乏，僅有少數羅非魚醛酮還原酶AKR1A1羰基解毒作用的報道；代海艷等(2017)初步探明黃鱔醛酮還原酶Eakr具有較好的羰基解毒作用。王全禾等(2017)重組表達了黃鱔醛酮還原酶基因并制備了其多抗，發現其在魚體中廣泛分布，并在多種淡水魚中具有同源類似物。

醛酮還原酶與腫瘤發生和發展、炎癥抑制、糖尿病發生和抑制、性激素調節密切相關(Penning TM，2015)。醛酮還原酶AKR7A3過表達可抑制腫瘤細胞的遷移和發生，并具有抑制NF-kB激活的作用。而對魚類醛酮還原酶在炎癥反應過程中的作用卻未可知。魚類醛酮還原酶在細菌感染過程中的作用是深入了解魚體天然免疫機制的重要內容。黃鱔醛酮還原酶Eakr的氨基酸序列與已報道的所有醛酮還原酶家族成員同源性均小于25％，且其催化四聯體氨基酸為(D-Y-A-H)，這與其他已知醛酮還原酶的催化四聯體存在一個氨基酸的差別。其酶學性質尚未可知，其功能亟待鑒定。

發明內容

本發明的目的在于提供一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的制備方法，通過將黃鱔Eakr第81位丙氨酸(A)進行定點突變為賴氨酸(K)，分析了突變蛋白Eakr^A81K的底物譜，比較野生型(Eakr)和突變型(Eakr^A81K)蛋白對不同代謝底物的活性，為深入了解黃鱔醛酮還原酶Eakr的功能及其催化四聯體在底物識別上的作用提供重要的參考資料，并鑒定突變蛋白的活性及在抑制炎癥因子產生中的作用，為進一步挖掘黃鱔醛酮還原酶的功能提供技術方法。

通過發明人大量實驗和不懈努力，獲得了一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白，該醛酮還原酶突變蛋白為黃鱔Eakr基因的A81K位點的突變，即黃鱔Eakr基因第81號位氨基酸對應的堿基由GCT突變成了AAG，其對應氨基酸也由丙氨酸突變成賴氨酸，其突變基因的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的制備，包括如下步驟：

(1)黃鱔Eakr基因A81K位點的突變