[發(fā)明專利]一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的制備及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810030128.0
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108192879B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李偉;孫文秀
• 申請（專利權(quán)）人: 長江大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

1.一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白，其特征在于：該醛酮還原酶突變蛋白為黃鱔Eakr基因的A81K位點的突變，即黃鱔Eakr基因第81號位氨基酸對應(yīng)的堿基由GCT突變成了AAG，其對應(yīng)氨基酸也由丙氨酸突變成賴氨酸，其突變基因的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一種黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的制備，其特征在于：包括如下步驟：

(1)黃鱔Eakr基因A81K位點的突變

提取黃鱔總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，根據(jù)黃鱔Eakr基因序列設(shè)計突變引物，進行重疊PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化和測序，黃鱔Eakr基因的第81號位氨基酸對應(yīng)的堿基由原來的GCT突變成了AAG，其對應(yīng)氨基酸也由丙氨酸突變成賴氨酸，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

(2)表達載體構(gòu)建及重組蛋白表達和純化

步驟A、將步驟(1)所得PCR產(chǎn)物與原核表達載體pET-28a(+)同時進行EcoRI和Hind III雙酶切，回收、純化、連接和轉(zhuǎn)化，并在含有卡那霉素的平板上進行抗性篩選，經(jīng)測序驗證后，成功構(gòu)建原核表達載體PET-Eakr^A81K；

步驟B、將原核表達載體pET-Eakr^A81K轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那霉素平板上進行抗性篩選，并經(jīng)菌落PCR驗證及SDS-PAGE電泳檢測獲得陽性表達菌株；以1％的接種量將能表達重組蛋白的BL21添加到含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，大量培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達；將誘導(dǎo)好的菌液離心，收集菌體超聲波破碎，再離心收集沉淀；將沉淀用平衡緩沖液溶解，收集上清，上樣、結(jié)合、洗脫、透析，獲得純化的黃鱔Eakr重組蛋白，實現(xiàn)了突變體蛋白Eakr^A81K的純化。

3.一種如權(quán)利要求1所述的黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的應(yīng)用，其特征在于，該突變蛋白可用于檢測醛類物質(zhì)及中長鏈酮類物質(zhì)的還原活性。

4.一種如權(quán)利要求1所述的黃鱔醛酮還原酶突變蛋白的應(yīng)用，其特征在于，該突變蛋白能夠抑制LPS誘導(dǎo)的肝臟組織IL-1β基因的表達水平，可抑制炎癥因子的產(chǎn)生。