[發(fā)明專利]可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810030000.4
• 申請(qǐng)日: 2018-01-12
• 公開（公告）號(hào): CN108148864B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒春林;滕夏虹;王麗惠;許倩倩;孫曉婷;盧奕;張健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10;C12N5/0735
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 靳浩

本發(fā)明提供了一種可支持人源飼養(yǎng)層細(xì)胞可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：S1、將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)；S2、將含有潮霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染S1中傳代培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，得到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；S3、將含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，得到TW2R細(xì)胞；S4、將含有E?cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒顆粒染入TW2R細(xì)胞，得到TWE3R細(xì)胞。本發(fā)明制得的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)E?cadherin蛋白，而且穩(wěn)定表達(dá)E?cadherin基因后不會(huì)影響TWE3R細(xì)胞的增殖能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)

人胚胎干細(xì)胞在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及新藥篩選方面有著廣闊的運(yùn)用應(yīng)用前景，而目前人胚胎干細(xì)胞(hESC)的培養(yǎng)，一般都需要小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，但是使用這些動(dòng)物源性材料會(huì)給今后臨床運(yùn)用帶來一定的生物安全問題。此外，由于一般只能用5代之內(nèi)MEF作為飼養(yǎng)層來培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，而不同批次胎鼠來源的MEF之間存在差異，維持人胚胎干細(xì)胞多能性生長(zhǎng)的能力也不一樣，這些都會(huì)給人胚胎干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)帶來不穩(wěn)定性。雖然加拿大著名的STEMCELL公司最近研發(fā)的TeSR^TM-E8^TM是一種成分高度確定、無需飼養(yǎng)層細(xì)胞(feeder-free)的培養(yǎng)基，適用于人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)，盡管TeSR-E8培養(yǎng)基能夠在沒有動(dòng)物蛋白的情況下支持干細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其中添加了人血清白蛋白和人源基質(zhì)蛋白，這就使得培養(yǎng)條件極其昂貴，不適合常規(guī)使用。因此，研究和開發(fā)可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的永生化人源性飼養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)于今后人胚胎干細(xì)胞運(yùn)用于臨床有著重要意義。

E-cadherin(鈣黏著素E)是鈣依賴性黏附分子的亞族成員，是一種跨膜蛋白，廣泛分布在非神經(jīng)上皮組織，它與細(xì)胞內(nèi)的特異性分子結(jié)合，參與同種親和性的細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附，胚胎發(fā)育以及正常組織中上皮細(xì)胞層的形成和維持。此外有研究顯示在維持胚胎干細(xì)胞的多能性方面，E-cadherin也起著重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法，制得的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E-cadherin基因從而穩(wěn)定表達(dá)E-cadherin蛋白，而且穩(wěn)定表達(dá)E-cadherin基因后不會(huì)影響TWE3R細(xì)胞的增殖能力。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1、將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于MSC培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

S2、將含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染S1中傳代培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，然后加入hygromycin B進(jìn)行篩選，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

S3、將含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，然后加入G418進(jìn)行篩選，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R細(xì)胞；

S4、將含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒顆粒感染S3中TW2R細(xì)胞中，然后加入puromycin進(jìn)行篩選，得到過表達(dá)E-cadherin的TWE3R細(xì)胞，即為人源飼養(yǎng)層細(xì)胞。

優(yōu)選的是，所述的可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法，S1中MSC培養(yǎng)基為每毫升培養(yǎng)基中含有0.08～0.1mL的胎牛血清、0.01～0.015mL的Antibiotic-Antimycotic、0.9～1.1ng的bFGF、以及余量的DMEM。