[發明專利]可支持人胚胎干細胞生長的人源飼養層細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201810030000.4
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108148864B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 鄒春林;滕夏虹;王麗惠;許倩倩;孫曉婷;盧奕;張健
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N5/0735
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理有限公司 11369
• 代理人: 靳浩

1.一種可支持人胚胎干細胞生長的人源飼養層細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、將人骨髓間充質干細胞置于MSC培養基中進行傳代培養；

S2、將含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆轉錄病毒顆粒感染S1中傳代培養的人骨髓間充質干細胞中，然后加入hygromycin B進行篩選，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓間充質干細胞；

S3、將含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆轉錄病毒顆粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓間充質干細胞中，然后加入G418進行篩選，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R細胞；

S4、將含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒顆粒感染S3中TW2R細胞中，然后加入puromycin進行篩選，得到過表達E-cadherin的TWE3R細胞，即為人源飼養層細胞。

2.如權利要求1所述的可支持人胚胎干細胞生長的人源飼養層細胞的制備方法，其特征在于，S1中MSC培養基為每毫升培養基中含有0.08～0.1mL的胎牛血清、0.01～0.015mL的Antibiotic-Antimycotic、0.9～1.1ng的bFGF、以及余量的DMEM。

3.如權利要求1所述的可支持人胚胎干細胞生長的人源飼養層細胞的制備方法，其特征在于，S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆轉錄病毒顆粒的制備方法包括以下步驟：

A1、將293T細胞接種至預先包被多聚賴氨酸溶液的培養皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培養24h，其中，FBS的體積分數為1％；

A2、在容器一中加入OPTI-MEM、然后依次加入hTERT RV-Vector、Gag/pol、VSV-G的病毒質粒，混勻，靜置；在容器二中加入OPTI-MEM、Lipofectamine 2000，混合均勻；將容器一和容器二中的原料混合均勻；

A3、將容器一和容器二中混合后的原料加入A1中的預先包被多聚賴氨酸溶液的培養皿中，混勻，置于培養箱培養48h后，收集含有病毒顆粒的細胞上清液，濃縮，得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆轉錄病毒顆粒；

其中，hTERT RV-Vector、Gag/pol、VSV-G、OPTI-MEM、DMEM、Lipofectamine 2000的質量體積比為14.9～15.1μg:5.8～6.1μg:2.8～3.2μg:1ml:18～20ml:34～36μl。

4.如權利要求1所述的可支持人胚胎干細胞生長的人源飼養層細胞的制備方法，其特征在于，S3中含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆轉錄病毒顆粒的制備方法包括以下步驟：

B1、將293T細胞接種至預先包被多聚賴氨酸溶液的培養皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培養24h，其中，FBS的體積分數為1％；

B2、在容器三中加入OPTI-MEM、然后依次加入Wnt3a RV-Vector、Gag/pol、VSV-G的病毒質粒，混勻，靜置；在容器四中加入OPTI-MEM、Lipofectamine 2000，混合均勻；將容器三和容器四中的原料混合均勻；

B3、將容器三和容器四中混合后的原料加入B1中的預先包被多聚賴氨酸溶液的培養皿中，混勻，置于培養箱培養48h后，收集含有病毒顆粒的細胞上清液，濃縮，得含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆轉錄病毒顆粒；

其中，Wnt3a RV-Vector、Gag/pol、VSV-G、OPTI-MEM、DMEM、Lipofectamine 2000的質量體積比為14.9～15.1μg:5.8～6.1μg:2.8～3.2μg:1ml:18～20ml:34～36μl。

5.如權利要求1所述的可支持人胚胎干細胞生長的人源飼養層細胞的制備方法，其特征在于，S4中含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒顆粒為LV6-homo E-cadherin病毒顆粒。