[發明專利]用于篩選飼料抗生素替代品的方法及其產品

有效

• 申請號: 201810028370.4
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108728417B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 符晨星;賀建華;方俊;伍小松;姚康
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/686;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種穩轉pg-PXR的IPEC-J2細胞系或細胞平臺用于篩選飼料中抗生素候選替代品的用途，其特征在于，所述穩轉pg-PXR的IPEC-J2細胞系或細胞平臺的制備方法，步驟包括：

（1）豬腸細胞中pgPXR的擴增：提取新鮮豬空腸上皮組織的總RNA，并逆轉錄為cDNA，設計引物后通過PCR擴增目的基因pgPXR，并回收純化目的基因片段；

（2）對目的基因片段和載體的雙酶切：用EcoRI和SalI將pgPXR的PCR純化產物及目的載體pCI-neo-vector雙酶切，并通過電泳鑒定并回收目的基因片段和載體；

（3）片段的酶連接：將酶切后的pgPXR基因帶和pCI-neo-vector載體帶進行連接，并于4℃連接過夜后，轉化感受態細胞；

（4）鑒定和篩選pg-PXR重組質粒：從轉化的感受態重組細胞提取質粒，進行EcoRI、SalI雙酶切，通過電泳鑒定質粒是否含有pg-PXR的pCI-neo-vector重組質粒；

（5）轉染豬空腸細胞IPEC-J2細胞：傳代的IPEC-J2細胞達到對數期后，將脂質體與pg-PXR重組質粒溶液混合后，加至IPEC-J2細胞表面進行轉染；

（6）篩選穩轉pg-PXR的IPEC-J2細胞系或細胞平臺：通過Real time PCR技術檢測豬腸細胞系中pgPXR mRNA的表達，或通過western blot技術檢測pgPXR mRNA或蛋白的表達，以篩選轉染的細胞；其中步驟（1）的引物序列包括：

SEQ 1-F：5’ GCGGAATTCGCCACCATGCAATGCAATGAAACAGACTCCA 3’

SEQ 2-R：5’ GCGGTCGACTCAGCTTTCTGTGATGCTGAATAAC 3’；以及

其中所述抗生素候選替代品為蒜氨酸。

2.根據權利要求1所述的用途，其中步驟（2）的反應體系充分混勻后置于37℃水浴過夜，待酶切反應完全，加入l0×Loading Buffer 5μL，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并通過DNA片段快速純化/回收試劑盒回收目的條帶。

3.根據權利要求2所述的用途，其中步驟（3）將酶切后的pgPXR基因帶和pCI-neo-vector載體帶，加入T4 DNA Ligase后，輕輕混勻反應液，4℃連接過夜，即用于轉化，其中所述感受態細胞是大腸桿菌DH5α感受態細胞。

4.根據權利要求3所述的用途，其中步驟（4）中，通過瓊脂糖凝膠進行鑒定，如果電泳結果有約1266bp pg PXR產物片段和約5200bp左右的pCI-neo-vector載體片段，則該質粒為含有pg-PXR的pCI-neo-vector重組質粒。

5.根據權利要求4所述的用途，其中步驟（5）中，將pCI-neo-vector重組質粒與脂質體LipofectamineTM2000混勻，然后將混合液加入細胞板中混勻，并將細胞置于37°C 、CO₂培養箱中培養5h后加入Rif，作用48h后收集細胞進行裂解后，利用RT-PCR與Western blot的方法確定Rif激活的pg-PXR信號強度。

6. 根據權利要求5所述的用途，其中將抗生素候選替代品處理所述細胞系或細胞平臺后，分別提取mRNA與細胞總蛋白，并通過Real time PCR技術檢測豬腸細胞系中pgPXR mRNA的表達或通過western blot技術檢測pgPXR蛋白表達，來確定抗生素候選替代品是否誘導豬腸道的PXR信號的產生或誘導豬腸道的PXR酶的表達。

7.根據權利要求1所述的用途，其中包括在誘導PXR信號的產生或PXR酶的表達的之前或之后，還聯合含有抗生素候選替代品的動物飼料對于動物生長性能的測定的步驟，以確定抗生素候選替代品是否為用于動物飼料的抗生素候選替代品。