[發明專利]用于篩選飼料抗生素替代品的方法及其產品

有效

• 申請號: 201810028370.4
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108728417B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 符晨星;賀建華;方俊;伍小松;姚康
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/686;G01N33/68
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本發明屬于基因重組技術領域，具體公開了一種通過重組質粒構建豬腸道PXR(pgPXR)細胞平臺來篩選抗生素替代品的方法，該過程包括以下步驟：目的基因pgPXR的提取，擴增，純化回收，酶切，連接，轉化與鑒定。該發明用到的材料主要包括：豬空腸上皮細胞系IPEC?J2，pCI?neo連接載體，以及DH5α感受態細胞。通過該技術可以得到穩定表達PXR受體的豬腸道細胞系，并作為有效的抗生素替代品篩選平臺。

技術領域

本發明涉及基因重組技術領域以及藥物篩選領域，更具體的，涉及一種PXR質粒的構建與連接表達方法以及基于腸道PXR信號活化的藥物篩選方法。

背景技術

孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)屬于核受體超家族(NR)中的一員，其主要生物學功能是參與機體對內源及外源化合物的代謝及排泄過程，從而維持機體內環境的穩態，由于近年來發現其具有重要的生物學和病理學功能，因此受到醫學領域的廣泛關注。以往的研究表明，PXR主要的生物學效應為“解毒”功能，即清除異源性和內源性有毒物質，是機體維持內環境穩態的重要組成部分。PXR可以通過誘導細胞色素P450(CYP)的表達來實現解毒功能，在腸中高度表達的CYP酶能催化底物分子羥基化或氧化，從而生成易于排泄的水溶性產物分子。有研究表明，PXR在機體中充當外源物感受器，在炎性疾病中起著重要的作用，通過抑制NF-κB活性減輕炎癥反應，從而在某些疾病的發生發展中發揮重要的病理生理功能。

其中，NR作為一類轉錄因子，其本身可被特異化學物質(天然或人工合成)激活或抑制，使它成為藥物作用的靶標。在肝腸系統中誘導CYP3A表達的PXR在藥物研發中具有重要的作用[Curr Drug M etab,2004,5(6):483-505.]。CYP3A負責代謝機體內60％以上的臨床用藥和肝毒性脂類藥物，其基因的表達可由PXR所誘導[J Biol Chem,2001,276(41):739-37742]，人PXR的無意義活化可導致不希望的藥物相互作用的發生或藥物代謝產物毒性的產生。利用細胞培養或轉基因小鼠模型，建立核受體介導的外源性化合物篩選系統，不僅有助于闡明藥物誘導反應的分子復雜性，同時也為加速開發高效低毒的安全藥物提供了體內和體外的平臺[Curr Drug Metab,2003,4(1):59-72.]。Moore等[Toxicology,2000,153(1/3):1-10.]將PXR表達質粒和熒光酶或堿性磷酸酶的報告質粒共轉染于真核細胞株中，在報告質粒的上游含有PXR反應元件，外源性配體結合PXR后，將激活報告基因的表達，由此而成功地建立了一種基于CYP450誘導機制的活性檢測系統。Luo等[Drug M etabDispos,2002,30(7):795-804.]對地塞米松、利福平等的研究表明，該檢測系統與傳統的肝細胞有很好的一致性，是檢測藥物和其他外源物誘導CYP3A4活性的可靠手段。已有結果證明PXR是一些抗生素類藥物的作用靶點，抗生素如利福平，通過PXR達到作用效果。總體而言，關于孕烷X受體，目前仍然集中于通過分析代謝性藥物相互作用而篩選臨床藥物。

抗生素作為飼料添加劑可以有效降低動物患病幾率，促進動物生長，從而降低養殖成本和提高養殖收益，因此在畜禽養殖生產中被長期、大量的使用，但隨著人們對人類健康和食品安全問題研究的不斷深入，飼用抗生素所帶來的負面效應已逐漸浮出水面，目前公認的飼用抗生素所帶來的危害主要有以下幾個方面：1)抗生素在長時間使用后會使細菌產生耐藥性，引發產生“超級細菌”；2)殘留在動物性食品中的抗生素，會間接危害人類自身的安全，造成食品安全問題；3)長期使用抗生素會造成畜禽機體的免疫力下降，抑制動物生長潛力，降低規模化的生產效率，增加了在養殖成本；4)大量抗生素通過排泄物進入周邊環境，對生態環境造成威脅。目前世界各國在控制飼用抗生素方面已紛紛采取措施，如歐美等發達國家已相繼禁止飼用抗生素的添加，而我國也已出臺相關法律法規，對飼用抗生素的種類、使用方法、劑量和配伍等方面嚴加限制。目前我國養殖業和飼料行業正在積極準備應對“后抗生素”時代，以減少今后飼用抗生素的限用或者禁用對養殖帶來的沖擊，而尋找飼用抗生素替代品是最主要的解決方案，但是由于目前潛在飼用抗生素替代品種類繁多，通過動物實驗進行篩選和鑒定周期長、效率低、成本高，因此建立一種高效、快速、成本低的篩選方法和技術平臺就顯得尤為重要。