[發(fā)明專利]一種水產養(yǎng)殖用寬譜噬菌體制劑及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810024877.2
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108103031B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設計）人: 劉莉;盧淑娟;呂孫建;曹錚;林鋒
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A01N63/40;A01P1/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.噬菌體毒株NTHP01在制備用于防治由遲緩愛德華氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、格瓦斯細菌、弗氏檸檬酸桿菌或腸桿菌引起的水產養(yǎng)殖細菌性病害的寬譜噬菌體制劑中的應用，其特征在于：所述寬譜噬菌體制劑由保藏號為CGMCC No.9623的噬菌體毒株NTHP01以基因工程大腸桿菌DH5α為宿主菌發(fā)酵制備。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述寬譜噬菌體制劑的制備方法包括以下步驟：

1）將大腸桿菌DH5α的新鮮菌液添加至培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，得到宿主菌發(fā)酵液；

2）將保藏號為CGMCC No.9623的噬菌體毒株NTHP01和MgCl₂母液投入至宿主菌發(fā)酵液中，混勻后靜置，然后進行增殖培養(yǎng)，得到發(fā)酵混合液；其中，增殖培養(yǎng)條件為：噬菌體毒株NTHP01添加時大腸桿菌DH5α的活化至OD₆₀₀為0.3-0.5，感染復數(shù)為10^-1-10^-2；溫度30-37℃培養(yǎng)5h以上；

3）將發(fā)酵混合液經(jīng)離心后，使噬菌體與宿主菌分離，得到寬譜噬菌體制劑。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；大腸桿菌DH5α的新鮮菌液添加至培養(yǎng)基中于37℃發(fā)酵培養(yǎng)3-4h。

4.如權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟2）中，向所述培養(yǎng)基中添加MgCl₂母液使培養(yǎng)基中MgCl₂濃度為4-30mM，混勻后靜置20-40min。

5.如權利要求2或4所述的應用，其特征在于，步驟2）中，增殖培養(yǎng)條件為：感染復數(shù)為10^-2，MgCl₂終濃度為4mM，溫度37℃，培養(yǎng)5h使OD₆₀₀為1.9。

6.如權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟3）中，離心條件為：5000-6000rpm/min，10-20min。

7.如權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟2）中，得到發(fā)酵混合液后，在進入步驟3）前，還經(jīng)過二級串聯(lián)發(fā)酵處理：

將發(fā)酵混合液和MgCl₂母液分別添加至大規(guī)模宿主菌發(fā)酵液中，使MgCl₂終濃度為4mM，混勻后靜置20-40min，進行二次發(fā)酵培養(yǎng)，得到二次發(fā)酵混合液；然后進入步驟3）；其中，二次發(fā)酵培養(yǎng)條件為：37℃，感染復數(shù)為10^-2，噬菌體添加時宿主菌活化至OD₆₀₀為0.3-0.5，培養(yǎng)5h。

8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述大規(guī)模宿主菌發(fā)酵液的制備方法如下：將大腸桿菌DH5α的新鮮菌液添加至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于37℃發(fā)酵培養(yǎng)20-24h；然后轉移至45-55倍體積的培養(yǎng)基中于37℃繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)3-4h。

9.如權利要求7或8所述的應用，其特征在于，步驟3）中，將二次發(fā)酵混合液通過蝶式離心機離心分離宿主菌，所得液體為寬譜噬菌體制劑。