[發明專利]一種基于基因重組發光菌的工業廢水生物毒性檢測方法

在審

• 申請號: 201810023633.2
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108226493A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 應光國;趙建亮;劉有勝;黃國勇;張芊芊;蔣宇霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州地球化學研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535;G01N21/76;G01N21/64
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

本發明公開一種基于基因重組發光菌的工業廢水生物毒性檢測方法，屬于環境監測技術領域。該方法選用發光菌Escherichia coli HB101 pUCD607作為檢測用細菌，包括以下步驟：第一步，制備發光菌的菌懸液。第二步，樣品梯度稀釋。第三步，樣品綜合毒性測定。本發明的方法對pH范圍要求不嚴格，不需要調節鹽度，適合于不同pH條件下工業廢水的發光菌綜合毒性測試，對工業廢水的綜合毒性十分敏感。本發明建立了發光菌的微孔板測試方法，采樣白色96孔板為實驗容器在酶標儀上進行生物發光強度的檢測，每塊板的96個孔可以同時測定，而且所需樣品體積可以從10mL縮小為250μL，實驗操作簡單便捷、快速。

技術領域

本發明屬于環境監測技術領域，具體涉及一種基于基因重組發光菌的工業廢水生物毒性檢測方法。

背景技術

工業廢水對水生態系統的危害程度一般用綜合毒性指標進行表征，該指標在廢水處理、排放和監管方面具有重要意義。常規理化檢測方法只能提供少數特定目標污染物的含量數據，難以評價廢水的綜合毒性。生物毒性檢測方法能夠反映污染負荷和生物學反應之間的定量關系，體現的是復雜體系中所有組分的綜合作用，包括各組分之間可能存在的加合作用、拮抗作用或協同作用。

發光菌暴露于有毒有害的工業廢水中時，發光強度受到抑制，且發光強度被抑制的程度與綜合毒性強度具有相關性。發光菌是一類正常的生理條件下能夠發射可見熒光的細菌。發光過程是細菌體內的一種新陳代謝過程，即氧化呼吸鏈上的光呼吸過程。在細菌熒光酶的催化作用下，菌體中的還原型黃素單核苷(FMNH2)和分子氧及一長鏈醛發生氧化還原反應，生成黃素單核苷(FMN)、羧酸(RCOOH)和水，并伴隨光的釋放。當發光菌接觸到工業廢水中有毒污染物質時，可影響或干擾細菌的新陳代謝，從而使細菌的發光強度下降。利用發光細菌的這一特性，以發光強度的變化為指標，來檢測工業廢水中有毒有害物質的生物毒性。

發光菌毒性實驗因其反應時間短、靈敏度高等優點而備受關注，用發光菌來檢測水體毒性現已成為一種簡單、快速的生物毒性檢測手段。目前國內外研究較多的是明亮發光桿菌、青海弧菌和費氏弧菌等。20世紀80年代發展起來的Microtox法是以海洋發光菌Vibrio fishieri為指示生物進行毒性測試，該方法快速經濟，應用較為廣泛。但其pH范圍要求嚴格(6～8)，且海洋發光菌因其在測試時需加一定量的NaCl(2％～3％)，而不適合淡水水體的毒性測試。明亮發光桿菌是我國常用的海洋發光菌，pH適應范圍窄，必須將樣品pH調至7.3～7.5后才能測定，可能導致樣品毒性失真。工業廢水成分復雜，pH范圍變化大，因此有必要發展一種更適合于工業廢水的發光菌綜合毒性測試方法。

發明內容

為了克服現有的海水發光菌毒性測試技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種基于基因重組發光菌的工業廢水生物毒性檢測方法。該方法對pH范圍要求不嚴格，不需要調節鹽度，適合于不同pH條件下工業廢水的發光菌綜合毒性測試。該方法克服了海水發光菌對pH和鹽要求嚴格，導致急性毒性檢測結果失真的局限性。具體方法選用發光菌Escherichia coli HB101 pUCD607作為檢測用細菌，包括以下步驟：第一步，制備發光菌的菌懸液。第二步，樣品梯度稀釋。第三步，樣品綜合毒性測定。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種基于基因重組發光菌的工業廢水生物毒性檢測方法，所述方法選用Escherichia coli HB101 pUCD607作為檢測用細菌，包括以下步驟：

第一步，制備發光菌的菌懸液：取凍存菌種，解凍后離心，去掉上清液后進行培養，第一次復蘇液重新接種到新培養液，再次培養至一定吸光度(OD)值，離心后棄去上清液，制成菌懸液備用；

第二步，樣品梯度稀釋：先將工業廢水從原液按10倍稀釋比例依次稀釋，初步檢測毒性后，確定最佳稀釋范圍，然后從最佳稀釋范圍的上限依次按2倍梯度進行樣品稀釋；