[發(fā)明專利]一種鑒別新城疫感染與免疫的間接ELISA方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810022726.3
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108362875A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 任濤;于得水;徐成剛;謝鵬;梁健鵬;林秋燕;廖明
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務(wù)所 44329
• 代理人: 楊曉松

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的免疫學(xué)檢測方法，具體涉及新城疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白V的特有羧基端結(jié)構(gòu)域在鑒別新城疫病毒感染與免疫中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明提供了一種能夠鑒別診斷新城疫滅活疫苗免疫與野毒感染的方法，其通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達V蛋白特有羧基端結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，并將該重組蛋白作為抗原，通過間接ELISA檢測方法，鑒別新城疫滅活疫苗免疫與野毒感染。本發(fā)明的方法具有高特異性，能夠快速和有效區(qū)分新城疫野毒感染與滅活疫苗免疫，進而有效控制病新城疫病毒的快速傳播。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的免疫學(xué)檢測方法，具體涉及新城疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白V特有羧基端結(jié)構(gòu)域的原核表達，以及利用該原核表達產(chǎn)物鑒別診斷新城疫病毒感染與滅活疫苗免疫的間接ELISA方法。

背景技術(shù)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的雞和多種禽類發(fā)病的急性、高度接觸性傳染病，廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將ND列為法定報告疫病，在我國ND被定為一類動物疾病，《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020)》將ND列為優(yōu)先防治的5種一類動物疫病之一。

在病毒分類學(xué)方面，NDV屬于副黏病毒科、禽腮腺炎病毒屬，其基因組為一條單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA，可分為6個基因片段，包括NP、P、M、F、HN和L，其中編碼磷酸化蛋白(P)的P基因在能在轉(zhuǎn)錄過程通過一種特殊的RNA編輯機制使其mRNA編碼框發(fā)生移碼，從而翻譯出另外兩種非結(jié)構(gòu)蛋白V和W。研究表明病毒復(fù)制過程由P基因產(chǎn)生的3種mRNA及相應(yīng)蛋白均能被檢測到，且3者的含量具有一定的比例關(guān)系，編碼P蛋白、V蛋白和W蛋白的mRNA分別約占69％、29％和2％。

區(qū)分動物的免疫與感染正是當(dāng)前倡導(dǎo)的實現(xiàn)安全控制病毒性疾病的一種手段，但目前常用的NDV血清學(xué)診斷方法并不能區(qū)分疫苗免疫與野毒感染。因此，建立一種能夠準(zhǔn)確、快速區(qū)分免疫滅活疫苗和感染活病毒動物的診斷方法在檢測和預(yù)防新城疫的發(fā)生以及活禽檢疫等方面都是十分必要的。

非結(jié)構(gòu)蛋白V產(chǎn)生于NDV的復(fù)制過程中，主要存在于感染病毒的宿主細(xì)胞內(nèi)，但并不參與病毒粒子的裝配(全病毒粒子內(nèi)可能會有極少量V蛋白殘留)。由于滅活病毒無法在動物體內(nèi)復(fù)制，不產(chǎn)生新的V蛋白，而野毒感染后的復(fù)制過程中會產(chǎn)生一定量的V蛋白，因此，可以根據(jù)不同的V蛋白抗體應(yīng)答水平來區(qū)分滅活疫苗免疫與野毒感染。

目前，國內(nèi)外已報道過利用口蹄疫、繁殖與呼吸綜合征、禽流感、雞傳染性支氣管炎等病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白建立的ELISA鑒別診斷方法，但尚未報道有利用NDV非結(jié)構(gòu)蛋白作為檢測抗原的血清學(xué)檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點與不足，本發(fā)明旨在通過新城疫病毒(NDV)V蛋白的特有的羧基端結(jié)構(gòu)域鑒別新城疫滅活疫苗免疫與野毒感染。更具體地，通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達V蛋白特有羧基端結(jié)構(gòu)域(簡稱Vc)的重組蛋白，并在利用該表達產(chǎn)物建立一種能夠鑒別診斷新城疫滅活疫苗免疫與野毒感染的ELISA檢測方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供了新城疫病毒V蛋白的羧基端結(jié)構(gòu)域(簡稱Vc)在制備鑒別新城疫病毒感染與滅活疫苗免疫的試劑盒中應(yīng)用。

所述的Vc的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其對應(yīng)的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。