[發明專利]一種鑒別新城疫感染與免疫的間接ELISA方法

在審

• 申請號: 201810022726.3
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108362875A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 任濤;于得水;徐成剛;謝鵬;梁健鵬;林秋燕;廖明
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

1.新城疫病毒V蛋白的羧基端結構域在制備鑒別新城疫病毒感染與免疫的試劑盒中應用。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的新城疫病毒V蛋白的羧基端結構域具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于編碼SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一種試劑盒，其含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有陰性對照、陽性對照、封閉液、顯色液、洗滌液。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照為未感染新城疫病毒也未接種新城疫疫苗的陰性血清；所述的陽性對照為新城疫病毒感染的陽性血清；

優選地，所述封閉液為脫脂奶粉；所述的顯色液為TMB；所述洗滌液為PBST緩沖液。

7.一種鑒別新城疫病毒感染與免疫的間接ELISH方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

S1.SEQ ID NO.1所示的新城疫病毒V蛋白的羧基端結構域的表達及純化；

S2.間接ELISA檢測。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟S1中，采用原核細胞表達；

優選采用大腸桿菌表達；

優選地，步驟S1，采用鎳離子親和層析柱進行純化。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，間接ELISA檢測具體包含以下步驟：

(1)抗原包被；

(2)封閉；

(3)孵育一抗；

(4)孵育酶標二抗；

(5)顯色；

(6)終顯色；

(7)測OD₄₅₀nm處吸光值；

(8)結果判定。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，抗原包被的濃度為0.4～1.6μg/mL，抗原包被為4℃過夜；優選地，抗原包被的濃度為0.8μg/mL；

優選地，步驟(2)中，封閉液為脫脂奶或BSA，封閉時間為1～3h；更優選地，封閉液為脫脂奶粉，封閉時間為2h；還更優選地，封閉液為7.5％的脫脂奶粉；

優選地，步驟(3)中，血清的稀釋濃度為1:25～1:100，一抗在35～39℃孵育45～90min；

更優選地，血清的稀釋濃度為1:50；一抗在37℃孵育60min；

優選地，步驟(4)中，酶標二抗稀釋倍數為1:6000～1:10000，二抗在35～39℃孵育30～90min；

更優選地，酶標二抗稀釋倍數為1:8000，二抗在37℃孵育60min；

優選地，步驟(5)中，顯色劑為TMB，在室溫避光顯色5～15min；更優選顯色10min；

優選地，步驟(6)中，終顯色采用的終止液為H₂SO₄；更優選地，為1M H₂SO₄；

優選地，步驟(7)中，采用酶標儀測OD₄₅₀nm處吸光值；

優選地，步驟(8)中，判定標準為：對樣品OD₄₅₀nm值進行S/P值校正，當S/P值≥0.29時判定為陽性，當S/P值≤0.24時判定為陰性，當S/P值介于兩者之間時為可疑值，需做進一步驗證。