[發明專利]一種非診斷目的的雞白痢和雞傷寒沙門氏菌的定量檢測方法

在審

• 申請號: 201810022503.7
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108362872A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 竇文超;趙廣英;朱海濤
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/569
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華;李欣瑋

1.一種非診斷目的的雞白痢和雞傷寒沙門氏菌的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將雞白痢和雞傷寒沙門氏菌抗體和葡萄糖氧化酶共價結合到二氧化硅納米微球的表面，形成酶標記物，備用；

(2)用雞白痢和雞傷寒沙門氏菌抗體對Fe₃O₄/SiO₂核殼結構的磁性納米顆粒表面進行修飾，得到抗體偶聯納米磁珠，備用；

(3)將步驟(2)制備得到的抗體偶聯納米磁珠加入到待測樣品懸浮液中于37℃孵育一定時間，經洗滌、磁性分離，得到具有磁性的免疫復合物A；

(4)在步驟(3)制備得到的免疫復合物中加入步驟(1)制備得到的酶標記物并于37℃孵育一定時間，經洗滌、磁性分離，得到具有磁性的免疫復合物B；

(5)在步驟(4)得到的免疫復合物B中加入葡萄糖進行酶催化反應；

(6)酶催化反應完成后，加入顯色試劑KSCN溶液，利用酶標儀測定樣品在波長466nm處的吸光度值，根據吸光度值為縱坐標，雞白痢和雞傷寒沙門氏菌濃度的對數值為橫坐標的標準曲線，能夠計算得到雞白痢和雞傷寒沙門氏菌含量。

2.如權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述的步驟(1)中的二氧化硅納米微球通過如下方法制備得到：

將Triton X-100、正己醇、環己烷混合攪拌均勻，之后加入超純水攪拌均勻形成W/O型微乳液，再加入原硅酸四乙酯，攪拌反應后，加入氨水作為催化劑發生水解縮合反應，再經破乳、離心、洗滌步驟，得到產物二氧化硅納米微球。

3.如權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中酶標記物的具體制備步驟如下：

(1)將二氧化硅納米微球超聲分散到無水乙醇中，再加入硅烷偶聯劑3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室溫條件下反應12h，用無水乙醇和磷酸鹽緩沖液分別洗滌至少三次，得到氨基化學改性的二氧化硅納米微球；

(2)將氨基化學改性的二氧化硅納米微球超聲分散至磷酸鹽緩沖液中，加入戊二醛溶液，避光攪拌反應3h，用磷酸鹽緩沖液洗滌多次，得到醛基改性二氧化硅納米微球；再加入雞白痢和雞傷寒沙門氏菌抗體，室溫條件下攪拌反應3h，以磷酸鹽緩沖液離心洗滌至少3次后重懸于磷酸鹽緩沖液中，加入葡萄糖氧化酶攪拌反應，得到酶標記物沉淀，加入牛血清白蛋白與酶標記物沉淀室溫攪拌反應以封閉酶標記物表面剩余的非特異性結合位點，得到酶標記物。

4.如權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中的Fe₃O₄/SiO₂核殼結構的磁性納米顆粒通過如下方法制備得到：

(1)將含Fe³⁺的溶液加入到已經預先除氧的去離子水中，加入FeSO₄·7H₂O，待上述FeSO₄·7H₂O固體溶解后快速加入氨水并劇烈攪拌，N₂保護條件下，80℃劇烈攪拌反應60min，待液體冷卻后，以去離子水充分洗滌，得到Fe₃O₄磁性納米顆粒；

(2)取Fe₃O₄磁性納米顆粒加入到無水乙醇、去離子水和氨水混合溶劑中，劇烈攪拌后，加入原硅酸四乙酯，于40℃恒溫水浴攪拌反應24h，得到磁性納米顆粒。

5.如權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中的抗體偶聯納米磁珠通過如下方法制備得到：

(1)將磁性納米顆粒分散到無水乙醇中，再加入硅烷偶聯劑3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室溫條件下反應12h后，用無水乙醇和磷酸鹽緩沖液分別洗滌三遍以上，得到氨基改性的磁性納米顆粒；

(2)將氨基改性的磁性納米顆粒重懸至磷酸鹽緩沖液中，加入戊二醛溶液，避光攪拌反應6h后，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌多次，得到醛基改性磁性納米顆粒；再加入雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌抗體，室溫條件下攪拌反應3h，洗滌，然后加入牛血清白蛋白與抗體偶聯納米磁珠沉淀室溫攪拌反應以封閉抗體偶聯納米磁珠表面非特異性結合位點，得到抗體偶聯納米磁珠。