[發(fā)明專利]高產(chǎn)尿苷的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810020944.3
• 申請(qǐng)日: 2018-01-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108130306B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝希賢;陳寧;吳鶴云;李國(guó)梁;李強(qiáng);范曉光;徐慶陽(yáng);張成林;李燕軍;馬倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/54;C12N15/70;C12P19/38
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發(fā)明提供一種高產(chǎn)尿苷的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該菌是在大腸桿菌的基因組上整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的嘧啶核苷操縱子pyrBCAKDFE，并由強(qiáng)啟動(dòng)子P_trc啟動(dòng)，重構(gòu)了尿苷合成途徑；在基因組上對(duì)其自身的PRPP合成酶編碼基因prsA進(jìn)行雙拷貝，由強(qiáng)啟動(dòng)子P_trc啟動(dòng)；同時(shí)缺失尿苷激酶(udk)、尿苷磷酸化酶(udp)和核苷水解酶(rihA、rihB和rihC)活性；缺失高絲氨酸脫氫酶1(thrA)活性；缺失鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(argF)活性。該基因工程菌應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)尿苷，在5L發(fā)酵罐發(fā)酵40?70h可生產(chǎn)尿苷40?67g/L，最大生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)1.5g/(L×h)，糖苷轉(zhuǎn)化率為15?25％，是目前報(bào)道的發(fā)酵法生產(chǎn)尿苷的最高水平。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)尿苷的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

尿苷是一種嘧啶核苷，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)。尿苷是構(gòu)成尿苷酸的前體，尿苷酸不僅可以作為調(diào)味品和制藥原料，還可作為食品添加劑添加到奶粉中，大幅度提高嬰兒的免疫力。尿苷可作為醫(yī)藥中間體生產(chǎn)一些抗病毒抗腫瘤藥物，如碘苷、溴苷、氟苷等，治療癌癥或病毒引起的疾病。尿苷具有十分重要的實(shí)用價(jià)值，市場(chǎng)對(duì)尿苷的需求量大，迫切需要成本低且能夠大規(guī)模生產(chǎn)的尿苷生產(chǎn)工藝。

目前尿苷的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、水解RNA法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法生產(chǎn)尿苷的方法存在反應(yīng)步驟多、反應(yīng)條件苛刻、操作繁瑣、環(huán)境污染較大和原料成本高的問(wèn)題；水解RNA法需要大量?jī)?yōu)質(zhì)RNA，原料不易得，成本高；微生物發(fā)酵法因其周期短、易控制、產(chǎn)率高、污染小等優(yōu)點(diǎn)，是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)尿苷的理想方法。

尿苷生產(chǎn)菌株的選育始于20世紀(jì)60年代，常用的出發(fā)菌株包括大腸桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等，特別是以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株選育尿苷生產(chǎn)菌的報(bào)道最多。生物體內(nèi)尿苷的代謝合成途徑比較長(zhǎng)，代謝調(diào)控系統(tǒng)也比較復(fù)雜，解除尿苷合成關(guān)鍵酶氨甲酰磷酸合成酶所受反饋?zhàn)瓒艉头答佉种谱饔檬悄蜍漳軌虼罅糠e累的關(guān)鍵。目前，尿苷高產(chǎn)菌株的選育多以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株采用誘變結(jié)合結(jié)構(gòu)類似物抗性平板篩選的方法。武田公司以野生型枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)多輪NTG誘變，篩選到一株尿苷磷酸化酶幾乎活性喪失的菌株No.556，能夠積累尿苷55g/L。誘變育種選育尿苷產(chǎn)生菌的方法周期比較長(zhǎng)，且多輪誘變所得菌株的遺傳背景復(fù)雜，生長(zhǎng)性狀不佳，菌種容易退化，菌種進(jìn)一步改良的難度大。

隨著基因工程育種技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是基因編輯技術(shù)的改良大大提高了細(xì)胞工廠的構(gòu)建效率，研究人員越來(lái)越青睞于對(duì)野生菌的染色體直接進(jìn)行定向修飾從而獲得各種生物制品的發(fā)酵菌株。朱暉等采用基因工程育種方法，對(duì)B.subtilis 168尿苷生物合成途徑中的一些相關(guān)基因進(jìn)行了敲除、修飾和過(guò)表達(dá)，構(gòu)建了產(chǎn)尿苷的重組菌株B.subtilisTD231-1，尿苷產(chǎn)量為1.48g/L；楊紹梅等以產(chǎn)尿苷的重組菌B.subtilis TD131為出發(fā)菌，對(duì)其磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶(prs)和氨甲酰磷酸合成酶(pyrAA/pyrAB)進(jìn)行點(diǎn)突變，同時(shí)異源表達(dá)了釀酒酵母的5′-核苷酸酶，最終得到菌株B.subtilis TD246，該菌搖瓶發(fā)酵尿苷產(chǎn)量為8.16g/L。雖然通過(guò)基因工程改造可獲得枯草芽孢桿菌尿苷產(chǎn)生菌，但是產(chǎn)苷水平低下，目前還達(dá)不到尿苷的工業(yè)化生產(chǎn)要求。另外，相對(duì)于大腸桿菌，枯草芽孢桿菌感受態(tài)效率低和基因重組效率低等原因，導(dǎo)致對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行系統(tǒng)定向改造的難度較大。而且枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)尿苷時(shí)，菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)源特別是有機(jī)氮源的需求高。為了大量積累尿苷，發(fā)酵培養(yǎng)基中需添加大量的玉米漿等有機(jī)氮源，不利于后續(xù)產(chǎn)品的分離純化，同時(shí)枯草芽孢桿菌發(fā)酵尿苷的周期長(zhǎng)達(dá)70多個(gè)小時(shí)，生產(chǎn)效率相對(duì)較低。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述存在問(wèn)題，本發(fā)明目的是提供一種高產(chǎn)尿苷的大腸桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法，并制定了相應(yīng)的發(fā)酵過(guò)程控制方案，可應(yīng)用于尿苷的高效工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明技術(shù)方案概述如下：