[發(fā)明專利]高產(chǎn)尿苷的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810020944.3
• 申請(qǐng)日: 2018-01-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108130306B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝希賢;陳寧;吳鶴云;李國(guó)梁;李強(qiáng);范曉光;徐慶陽(yáng);張成林;李燕軍;馬倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/54;C12N15/70;C12P19/38
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

1.一種高產(chǎn)尿苷的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大腸桿菌E. coliW3110的基因組上整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的嘧啶核苷操縱子pyrBCAKDFE，并由強(qiáng)啟動(dòng)子P_trc啟動(dòng)；在基因組上對(duì)其自身的PRPP合成酶編碼基因prsA進(jìn)行雙拷貝，并由強(qiáng)啟動(dòng)子P_trc啟動(dòng)；同時(shí)缺失尿苷激酶udk、尿苷磷酸化酶udp以及核苷水解酶rihA、rihB和rihC活性；缺失高絲氨酸脫氫酶thrA活性；缺失鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶argF活性。

2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大腸桿菌E.coli W3110的基因組上，將核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的嘧啶核苷操縱子pyrBCAKDFE整合在假基因yghX位點(diǎn)處；將udk、udp、rihA、rihB和rihC五個(gè)基因敲除；構(gòu)建啟動(dòng)子P_trc和prsA基因的連接片段P_trc-prsA，并將其整合在trpR基因位點(diǎn)；將thrA基因敲除；將argF基因敲除。

3. 如權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述嘧啶核苷操縱子來(lái)源于B.subtilis CGMCC No.11775。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述高產(chǎn)尿苷的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)對(duì)E. coli W3110進(jìn)行定向改造，包括如下步驟：

（1）在E. coli W3110中重構(gòu)尿苷合成代謝途徑：在E. coli W3110的基因組上，按順序依次將來(lái)源于B. subtilis CGMCC No.11775的嘧啶核苷操縱子pyrBCAKDFE整合在假基因yghX位點(diǎn)處；

（2）將udk、udp、rihA、rihB和rihC五個(gè)基因依次敲除，阻斷尿苷的降解；

（3）構(gòu)建啟動(dòng)子P_trc和prsA基因的連接片段P_trc-prsA，并將其整合在trpR基因位點(diǎn)，促進(jìn)前體物PRPP的積累；

（4）將thrA基因敲除，減弱前體物天冬氨酸的支路代謝；

（5）將argF基因敲除，減弱前體物氨甲酰磷酸的支路代謝。

5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的基因工程菌在生產(chǎn)尿苷中的用途。

6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，包括：

將權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)基因工程菌活化后制備種子液；

采用搖瓶發(fā)酵：按10-15%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，終體積為30 mL，九層紗布封口，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加氨水維持pH在7.0-7.2；補(bǔ)加60% (m/v)葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行；發(fā)酵周期24-30 h；

或，采用發(fā)酵罐發(fā)酵：按照15-20%接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中控制pH穩(wěn)定在7.0左右，溫度維持在37℃，溶氧在25-35%之間；當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完之后，流加80% (m/v)的葡萄糖溶液，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度在0.1-5 g/L；發(fā)酵周期40-70 h。

7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20-40 g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-3 g/L，KH₂PO₄ 1-3 g/L，MgSO₄·7H₂O 1-2 g/L，酵母提取物0.1-0.3 g/L，玉米漿1-2 mL/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 80-100 mg/L，MnSO₄·7H₂O 80-100 mg/L，其余為水，pH 7.0-7.2。

8.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述發(fā)酵罐發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖 15-25 g/L，酵母提取物1-5 g/L，胰蛋白胨1-5 g/L，檸檬酸鈉 0.1-1 g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1 g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 80-100 mg/L，MnSO₄·H₂O 80-100 mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各0.5-2 mg/L，蘇氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸各50-200 mg/L，消泡劑2滴，其余為水，pH 7.0-7.2。