[發(fā)明專利]雞環(huán)RNAChr26:2670958|2679178的檢測引物、方法及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810020111.7
• 申請日: 2018-01-09
• 公開（公告）號: CN107988404A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李顯耀;鄭林娜;劉麗英;王園美
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11246
• 代理人: 夏艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種雞環(huán)RNAChr26:2670958|2679178的檢測引物、方法及應用。

背景技術(shù)

腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis，SE)是常見的人畜共患病原菌，因其無宿主特異性，因此不僅能夠引起家禽急性胃腸炎等疾病甚至發(fā)病致死，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，而且嚴重危害人類健康，造成食物中毒，是影響人身心健康的重要病原菌之一。有關(guān)報道指出，2004年期間，在美國每1百萬人中有19000人因感染沙門氏菌而住院，多達300人因沙門氏菌感染出現(xiàn)死亡；在歐盟，2010年間約有99020起因沙門氏菌感染引起的食源性疾病爆發(fā)。家禽及其相關(guān)加工產(chǎn)品是腸炎沙門氏菌的主要傳染源，盲腸是其主要宿主，腸炎沙門氏菌能夠透過蛋殼進入雞蛋產(chǎn)品中，且能在生殖道中寄存繁殖。目前控制沙門氏菌感染的主要方法是使用疫苗和抗生素，但這不能從根本上解決問題，而且抗生素的大量使用會引起食品安全問題及細菌的耐藥性，且造成菌株耐藥性增強。隨著分子遺傳學的發(fā)展，提高畜禽對疾病和病原的遺傳抗性，為控制沙門氏菌的感染提供新的可能性。

環(huán)RNA是一種新型的非編碼RNA。環(huán)RNA呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定，不易降解。不含有5’-3’極性。但是環(huán)RNA在動物中具有組織特異性的廣泛豐富的表達。在功能上，近年的研究表明，環(huán)RNA分子富含microRNA(miRNA)結(jié)合位點，在細胞中起到miRNA海綿(miRNA sponge)的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高來源基因的表達水平；這一作用機制被稱為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)機制。通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，環(huán)RNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種雞環(huán)RNA Chr26:2670958|2679178的檢測引物、方法及應用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種雞環(huán)RNA Chr26:2670958|2679178的檢測引物，包括雞環(huán)RNA Chr26:2670958|2679178環(huán)狀上游引物和雞環(huán)RNA Chr26:2670958|2679178環(huán)狀下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還公開了一種雞環(huán)RNA Chr26:2670958|2679178的檢測方法，包括以下步驟：

步驟1、待測樣本RNA的提取；

步驟2、進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

步驟3、用權(quán)利要求1中所述的引物，對待測樣本cDNA進行定量PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；

步驟4、采用2^-△△CT方法計算基因相對表達量，具體計算公式如下：

△CT＝CT_目的基因-CT_GAPDH，△△CT＝△CT_目的基因-△CT_參照基因；

其中，△CT代表所需驗證基因的CT值減去內(nèi)參基因的CT值；

CT_目的基因代表所需驗證基因的CT值；

CT_GAPDH代表內(nèi)參基因的CT值；

△△CT代表目的基因的△CT值減對照組目的基因△CT的平均值；

△CT_目的基因代表目的基因的△CT值；

△CT_參照基因代表對照組目的基因△CT的平均值；

步驟5、根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物及基因相對表達量判斷待測樣本是否含有環(huán)RNA Chr9:10814512|10838667基因及其表達情況。

進一步地，所述步驟1中的待測樣本RNA的提取具體為：采用Trizol法提取樣品總RNA，抽提所得總RNA經(jīng)安捷倫生物分析儀2100和Qubit 2.0進行質(zhì)檢。

進一步地，所述步驟2中的待測樣本cDNA的提取具體按照以下步驟實施：選擇腸炎沙門氏菌陰性個體，通過口服方法接種腸炎沙門氏菌，接種量為10⁷-10⁹cfu/只，接種后第7天，取盲腸內(nèi)容物，利用平板計數(shù)法測定細菌含量。采取盲腸組織樣，提取RNA，并用RNaseR對提取的RNA進行處理，消化掉線性RNA，進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。